溫陽補腎方對兔激素性股骨頭壞死VEGF及RANKL-RANK-OPG通路的影響.pdf

1、目的：
　　通過動物實驗研究，探討溫陽補腎方對激素性股骨頭壞死組織VEGF及RANKL/RANK/OPG通路表達的影響，從分子水平探討溫陽補腎方治療激素性股骨頭壞死的作用機制，為溫陽補腎方的治則治法提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1、兔激素性股骨頭壞死模型的建立
　　1.1造模:用改進的馬血清聯(lián)合甲強龍的方法，新西蘭大白兔精確稱重，按10 mL·kg-1的劑量經(jīng)兔耳緣靜脈注射馬血清。間隔3周，按6mL·kg-1的

2、劑量再次注射馬血清。間隔2周后，按45 mg·kg-1的劑量腹腔注射甲基強的松龍，連續(xù)3天，每天一次。注射激素期間，每天每只大白兔腹腔注射青霉素10萬單位，連續(xù)7天，預防感染。
　　1.2動物模型鑒定:運用空氣栓塞法處死，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察股骨近端骨組織和骨髓組織的骨小梁、骨髓造血組織、成骨細胞、骨細胞、脂肪細胞的病理改變。若觀察到骨細胞部分核深染，較多的細胞核固縮，核偏位。骨小梁內(nèi)正常骨細胞數(shù)量減少，骨陷窩內(nèi)骨細胞消失，空

3、骨陷窩數(shù)明顯增多，提示造模成功。
　　2、溫陽補腎方對兔激素性股骨頭壞死股骨頭形態(tài)學及血清VEGF、RANKL、RANK、OPG含量的影響
　　2.1動物實驗:136只新西蘭大白兔隨機分為5組:正常組、模型組、中藥低(6.44g/kg·d)、中(9.66 g/kg·d)、高(12.88 g/kg·d)劑量組（造模按改進的馬血清聯(lián)合甲強龍的方法）。正常組和模型組每日用生理鹽水灌胃10mL。中藥治療組給予不同濃度的溫陽補腎方進行

4、灌胃。分別于給藥后第4、8、12周取雙側(cè)股骨頭、血清。
　　2.2指標檢測:股骨頭石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色，光鏡下進行骨組織形態(tài)計量學指標測定;計算空骨陷窩比率;行電子染色，透射電鏡觀察股骨頭壞死組織中骨細胞超微結構的改變;運用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清VEGF、RANKL、RANK、OPG的含量。
　　3、溫陽補腎方對兔激素性股骨頭壞死組織VEGF及RANKL/RANK/OPG通路的影響
　　3.1動物實驗:136只新

5、西蘭大白兔隨機分為5組:正常組、模型組、中藥低(6.44g/kg·d)、中(9.66 g/kg·d)、高(12.88 g/kg·d)劑量組（造模按改進的馬血清聯(lián)合甲強龍的方法）。正常組和模型組每日用生理鹽水灌胃10mL。中藥治療組給予不同濃度的溫陽補腎方進行灌胃。根據(jù)實驗二結果，選取給藥第8周所取材備用的股骨頭。
　　3.2指標檢測:分別提取股骨頭組織RNA和蛋白，RT-PCR法檢測VEGF及RANKL、RANK、OPG的mRNA

6、表達，Western-Blot法檢測目的蛋白的表達。
　　結果：
　　1、模型鑒定結果
　　成功建立了新西蘭大白兔SANFH模型。造模后大白兔四肢活動減少，精神狀態(tài)萎靡，飲食飲水減少，大便減少，毛發(fā)光澤暗淡，甚至出現(xiàn)大量掉毛。體重明顯下降，皮下脂肪減少。股骨頭軟骨面顏色偏暗紅，表面光澤暗淡，觸摸略微粗糙，且骨質(zhì)較脆，截取容易。股骨頭石蠟切片HE染色見模型組股骨頭軟骨層變薄，部分軟骨面出現(xiàn)剝脫裂紋。骨小梁結構松散不規(guī)則，

7、細長而窄，甚至出現(xiàn)斷裂。軟骨細胞和骨細胞減少，且骨細胞腫大，出現(xiàn)較多的空骨陷窩，髓腔可見大量肥大的脂肪細胞，骨髓細胞減少，造模成功。
　　2、股骨頭石蠟切片HE染色觀察
　　溫陽補腎方可改善SANFH股骨頭病理變化。模型組股骨頭軟骨層變薄，部分軟骨面出現(xiàn)剝脫裂紋。骨小梁結構松散不規(guī)則，細長而窄，甚至出現(xiàn)斷裂。軟骨細胞和骨細胞減少，且骨細胞腫大，出現(xiàn)較多的空骨陷窩，髓腔可見大量肥大的脂肪細胞，骨髓細胞減少。第4、8、12周時，

8、中藥低、中、高劑量組空骨陷窩率均明顯低于模型組。從各時間點顯示中藥組所用藥物劑量與空骨陷窩率成反比。各時間點低劑量、中劑量、高劑量中藥組之間差異明顯。
　　3、酶聯(lián)免疫法檢測血清VEGF、OPG、RANK、RANKL濃度
　　溫陽補腎方可上調(diào)血清OPG含量下調(diào)血清RANKL、RANK含量。第4周時，中藥中、高劑量組VEGF、RANK、RANKL明顯低于模型組，而OPG明顯高于模型組。第8周、第12周時，中藥低、中、高劑量組V

9、EGF、RANK、RANKL明顯低于模型組，而OPG明顯高于模型組。以第8周作為變化明顯的時間點。
　　4、股骨頭壞死組織中骨細胞超微結構觀察
　　溫陽補腎方可改善SANFH壞死組織中骨細胞超微結構的變化。模型組骨細胞核固縮，異染色質(zhì)聚集甚至核碎裂，多被巨大脂滴壓縮到一側(cè)，細胞壞死凋亡形成空骨陷窩，周圍的膠原纖維粗大且紊亂。中藥低、中、高劑量治療后細胞結構均有所好轉(zhuǎn)。
　　5、RT-PCR檢測股骨頭壞死組織VEGF及R

10、ANKL、RANK、OPG的mRNA表達
　　溫陽補腎方可提高VEGF及OPG的mRNA表達，降低RANKL及RANK的mRNA表達。模型組股骨頭壞死組織VEGF與OPG的mRNA表達減低，RANK和RANKL的mRNA表達升高。中藥各劑量組VEGF與OPG的mRNA表達均升高，RANK和RANKL的mRNA表達均降低，且中、高劑量組比低劑量組升高更明顯，中、高劑量組之間無差異。用藥劑量與VEGF和OPG mRNA相對表達量呈正比

11、，與RANK和RANKL的mRNA表達呈反比。
　　6、Western-Blot檢測股骨頭壞死組織VEGF及RANKL、RANK、OPG蛋白的表達
　　溫陽補腎方可提高VEGF及OPG的蛋白表達，降低RANKL及RANK的蛋白表達。模型組股骨頭壞死組織VEGF與OPG的蛋白表達減低，RANK和RANKL的蛋白表達升高。中藥各劑量組VEGF與OPG的蛋白表達均升高，RANK和RANKL的蛋白表達量有減低的趨勢;且中、高劑量組比

12、低劑量組升高更明顯，中、高劑量組之間無差異。用藥劑量與VEGF和OPG蛋白相對表達量呈正比，與RANK和RANKL的蛋白表達量呈反比。
　　7、VEGF與RANKL/RANK/OPG相關性
　　血液與組織的VEGF與RANKL/RANK/OPG相關性分析均提示:相關性在0.01水平上顯著（雙尾）。表明血液中與組織中VEGF表達均與OPG表達水平正相關，與RANKL、RANK表達負相關。
　　結論：
　　1、溫陽補

13、腎方可提高VEGF的表達，從而促進股骨頭內(nèi)血管新生，增強骨組織自身修復能力，發(fā)揮治療激素性骨頭壞死作用。
　　2、溫陽補腎方可調(diào)節(jié)RANK/RANKL/OPG通路的功能，抑制破骨細胞的過度活化，使骨代謝恢復動態(tài)平衡，能促進新骨的形成，可能是治療激素性股骨頭壞死的機制之一。
　　3、血液中與組織中VEGF表達均與OPG表達水平正相關，與RANKL、RANK表達負相關。溫陽補腎方治療SANFH取效的機制之一，可能是通過提高VEG