兩種藥物對酒精暴露后小鼠腦發(fā)育的作用.pdf

1、隨著社會進(jìn)步，經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人們生活水平改善，飲酒變得越發(fā)普遍。酒精是一種中樞神經(jīng)抑制劑，長期或一次過量酒精攝入均可以引起酒精中毒，損害多系統(tǒng)器官，例如消化和心血管系統(tǒng)，以及神經(jīng)系統(tǒng)等，甚至可引起癌癥發(fā)生[1-4]。在發(fā)育過程中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central nervous system，CNS）對酒精刺激非常敏感[5，6]。孕期高劑量酒精暴露后，胎兒可以表現(xiàn)為出生后生長發(fā)育遲緩、面容異常、CNS功能障礙等[7-9]，即胎兒酒精綜合征(Fe

2、tal alcohol syndrome，F(xiàn)AS)。有研究表明，新生期小鼠在單次酒精注射后可引起新生期小鼠大腦海馬區(qū)域神經(jīng)干細(xì)胞損傷，小腦蒲肯野細(xì)胞和伯格曼膠質(zhì)細(xì)胞損傷，以及神經(jīng)細(xì)胞丟失[10，11];酒精對青春期邊緣系統(tǒng)尤其對青春期海馬更容易產(chǎn)生損傷作用，導(dǎo)致記憶受損[12-14]。磁共振成像研究顯示酗酒和酒精依賴的青少年海馬體積減小，同時(shí)相關(guān)功能研究顯示海馬的學(xué)習(xí)和記憶受到損害[15-19]。海馬持續(xù)進(jìn)行神經(jīng)發(fā)生，并參與海馬學(xué)習(xí)記憶

3、等認(rèn)知功能。有研究也顯示，青春期大鼠酒精暴露容易造成海馬結(jié)構(gòu)損傷和行為學(xué)功能異常[20]，甚至可影響神經(jīng)發(fā)生[21]。
　　放射狀膠質(zhì)細(xì)胞(Radial glial cells，RGCs)是組織形態(tài)、生化特性和功能方面獨(dú)特的一類細(xì)胞，也是胚胎期間最早出現(xiàn)的具有干細(xì)胞功能的膠質(zhì)細(xì)胞。其胞體位于腦室區(qū)(Ventricular zone，VZ)，即早期神經(jīng)管內(nèi)壁的神經(jīng)上皮層，細(xì)胞一端伸出一短的頂突附著于室管膜表面，另一端伸出細(xì)長且有短側(cè)

4、突的基底突起，并分出許多分支并終止于軟腦膜側(cè)。RGCs在CNS的發(fā)育過程中扮演著非常重要的角色，被認(rèn)為是神經(jīng)干細(xì)胞[22]，它的發(fā)育與分化受到許多因素誘導(dǎo)調(diào)控[23]。另外，RGCs作為干細(xì)胞也存在于成年CNS內(nèi)兩個增殖區(qū)域:側(cè)腦室壁的腦室下區(qū)（Subventricular zone，SVZ）和海馬齒狀回(Dentate gyrus，DG)的顆粒下區(qū)（Subgranular zone，SGZ）[24]。RGCs作為一種神經(jīng)祖細(xì)胞，在板層

5、結(jié)構(gòu)（皮層、海馬和小腦）發(fā)育過程中，可作為神經(jīng)前體細(xì)胞產(chǎn)生膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元，其膠質(zhì)長纖維還可以充當(dāng)“腳手架”作用引導(dǎo)神經(jīng)元進(jìn)行放射狀遷移[23,25，26]。
　　RGCs在海馬齒狀回(DG)可分為初級RGCs和次級RGCs。其中，初級RGCs與大腦皮質(zhì)內(nèi)的RGCs具有相似的結(jié)構(gòu)形態(tài)，大部分位于海馬DG區(qū)域（出生前），分布范圍:從海馬傘部至DG的軟腦膜表面。RGCs放射狀膠質(zhì)纖維可引導(dǎo)新生神經(jīng)元或前體細(xì)胞從神經(jīng)上皮向齒狀回原基進(jìn)行

6、遷移。而次級RGCs來自于海馬DG區(qū)域（出生后早期）的非放射狀前體細(xì)胞，維持生后海馬DG的形態(tài)發(fā)生。次級RGCs充分發(fā)揮它的放射狀膠質(zhì)纖維“支架”作用，引導(dǎo)顆粒神經(jīng)元遷移，并部分分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞。只有少數(shù)次級RGCs保留至成年而且作為神經(jīng)干細(xì)胞參與到成年DG的神經(jīng)發(fā)生中[23][15]。
　　伯格曼膠質(zhì)細(xì)胞（Bergman glial cell，BG）作為小腦內(nèi)的RGCs，其結(jié)構(gòu)形態(tài)與海馬及皮層內(nèi)的RGCs相似，放射狀長纖維向軟

7、腦膜表面延伸[11,26]。在小腦皮質(zhì)發(fā)生過程中，BG為不同類型的細(xì)胞提供“腳手架”遷移，促進(jìn)小腦葉狀結(jié)構(gòu)和分層模式的正常發(fā)育，并且可以調(diào)節(jié)軸突和樹突的生長方向[26]。近年來研究顯示BG影響蒲肯野細(xì)胞的樹突發(fā)育，BG的纖維引導(dǎo)蒲肯野細(xì)胞的樹突生長，影響樹突棘的形成;而隨著發(fā)育的進(jìn)程，伯BG的纖維能夠促進(jìn)蒲肯野細(xì)胞的突觸形成，確保信號之間的正常傳導(dǎo)[27]。也有報(bào)道指出，保持BG的長纖維“支架”可以維持蒲肯野細(xì)胞的存活[28]。

8、　　為探究如何改善酒精暴露導(dǎo)致的腦發(fā)育損傷，我們用催產(chǎn)素(Oxytocin，OT)和白藜蘆醇(Resveratrol，RSV)進(jìn)行干預(yù)，分別觀察OT和RSV對酒精暴露后青春期小鼠大腦和新生期小鼠小腦發(fā)育的影響，以期這些干預(yù)能改善酒精暴露后的腦發(fā)育損傷，并為臨床上提供一種新的治療手段。
　　OT是一種神經(jīng)肽（由9個氨基酸構(gòu)成），大部分由下丘腦視上核和室旁核合成。它的分泌受下丘腦—垂體—牲腺軸的調(diào)控，在青春期，下丘腦—垂體—性器官的發(fā)

9、育趨于成熟，催產(chǎn)素分泌達(dá)到新的水平。最初臨床應(yīng)用催產(chǎn)素來加強(qiáng)子宮收縮來治療滯產(chǎn)，又稱“縮宮素”;隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)催產(chǎn)素的功能和作用十分廣泛，近年來有研究報(bào)道催產(chǎn)素可以促進(jìn)細(xì)胞增殖以及海馬神經(jīng)發(fā)生[29]，而且在哺乳動物的母性行為、配偶結(jié)合、社會認(rèn)同、壓力和焦慮等社交行為中也發(fā)揮重要的作用[30，31]。目前有關(guān)催產(chǎn)素對酒精暴露后青春期小鼠大腦發(fā)育的作用研究不多。因此，在青春期小鼠酒精暴露后，我們用OT進(jìn)行干預(yù)，以期可以改善酒精暴

10、露導(dǎo)致的大腦發(fā)育損傷。
　　關(guān)于RSV，主要存在于紅葡萄皮和某些藥用植物中的一種天然的對二苯代乙烯類物質(zhì)[32,33]。我們實(shí)驗(yàn)室前期研究顯示，酒精暴露后RSV可以保護(hù)新生期小鼠大腦海馬齒狀回的RGCs，促進(jìn)其神經(jīng)發(fā)生，減輕酒精暴露導(dǎo)致的新生期小鼠大腦發(fā)育損傷，而有關(guān)RSV是否能夠改善酒精暴露后新生期小鼠小腦發(fā)育損傷的研究不多，相關(guān)作用途徑及機(jī)制尚不明確。因此，基于我們的前期研究，在本課題中，新生期小鼠酒精暴露后，我們采用RSV進(jìn)

11、行處理，以期可以改善酒精暴露后引起的新生期小鼠小腦發(fā)育損傷。
　　方法與結(jié)果:
　　第一部分 OT對酒精暴露后青春期小鼠大腦發(fā)育的作用
　　1.應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，采用溴脫氧核苷尿嘧啶(Bromodeoxyuridine，BrdU)對大腦海馬齒狀回SGZ區(qū)域的增殖細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，顯示OT使酒精暴露后青春期小鼠大腦海馬齒狀回SGZ區(qū)域增殖細(xì)胞數(shù)量增加。
　　2.應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，采用小清蛋白(Parvalbum

12、in，PV)標(biāo)記大腦海馬齒狀回SGZ區(qū)域的PV陽性中間抑制性神經(jīng)元，顯示OT使酒精暴露后青春期小鼠大腦海馬齒狀回SGZ區(qū)域PV陽性中間神經(jīng)元數(shù)量增加。
　　3.應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，采用性別決定相關(guān)HMG盒2(Sry-related HMG box2，Sox2)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein，GFAP）熒光共標(biāo)對大腦海馬齒狀回SGZ區(qū)域的RGCs進(jìn)行標(biāo)記，顯示OT可能會使酒精暴露

13、后青春期小鼠大腦海馬齒狀回RGCs數(shù)量增加。
　　第二部分 RSV對酒精暴露后新生期小鼠小腦發(fā)育的作用
　　1.應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，采用鈣結(jié)合蛋白D-28K（Calbindin D-28k，CBD-28K或CB）標(biāo)記小腦的蒲肯野細(xì)胞，顯示RSV使酒精暴露后新生期小鼠小腦CBD-28K標(biāo)記蒲肯野細(xì)胞數(shù)量增加。
　　2.應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，分別采用腦脂質(zhì)結(jié)合蛋白(Brain lipid-binding protein，

14、BLBP)和GFAP標(biāo)記小腦的伯格曼膠質(zhì)細(xì)胞，顯示RSV使酒精暴露后新生期小鼠小腦伯格曼膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加。
　　3.應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，采用小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba1(Ionized calcium-binding adapter molecule1，Iba1)標(biāo)記小腦的小膠質(zhì)細(xì)胞和蛋白免疫印跡法(Western blot，WB)檢測小腦內(nèi)核因子-κ結(jié)合基因(Nuclear factor-κ-gene binding，NF-κB)