低溫3D打印技術(shù)聯(lián)合冷凍干燥法制備SF-COL-nHA仿生骨組織工程支架及其性能的研究.pdf

1、目的：
　　骨組織工程技術(shù)是骨缺損結(jié)構(gòu)及功能性修復(fù)的關(guān)鍵，為重建骨缺損部位的功能結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)骨組織工程支架結(jié)構(gòu)和力學(xué)環(huán)境與正常骨組織的仿生，本課題組以絲素蛋白、膠原蛋白和納米羥基磷灰石作為原料，采用低溫三維打印技術(shù)和真空冷凍干燥技術(shù)制備仿生復(fù)合骨組織工程支架，并以小鼠成骨細(xì)胞系MC3T3-E1作為種子細(xì)胞定向構(gòu)建功能性骨單元，從而為骨缺損的治療提供一定的理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.骨組織工程支架原料的提取：家蠶絲經(jīng)過

2、堿液煮沸、脫膠、透析及濃縮后提取得到絲素蛋白。新鮮牛肌腱經(jīng)含胃蛋白酶的醋酸溶液處理后通過鹽析法制得膠原蛋白。
　　2.仿生復(fù)合骨組織工程支架的制備：將質(zhì)量比為3:9:2的絲素蛋白、膠原蛋白和納米羥基磷灰石充分?jǐn)嚢杌靹蛑萌?4孔板中，-80℃過夜后使用真空冷凍干燥機(jī)制備復(fù)合材料支架（編號(hào)A組）。同時(shí)取相同質(zhì)量比的絲素蛋白、膠原蛋白和納米羥基磷灰石充分?jǐn)嚢杌靹蜓b入低溫打印機(jī)料筒，設(shè)置三維打印控制參數(shù)，使用低溫三維打印機(jī)和真空冷凍干燥機(jī)

3、制備復(fù)合材料支架（編號(hào)B組）。兩組支架經(jīng)過無水乙醇、NaOH溶液及Co60滅菌處理后備用。
　　3.仿生骨支架理化性能的檢測(cè)：采用微計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)對(duì)A組和B組支架結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，力學(xué)試驗(yàn)機(jī)檢測(cè)仿生支架的力學(xué)性能。采用 X射線多晶衍射儀、付立葉變換紅外光譜儀以及示差掃描量熱儀分析支架材料的分子結(jié)構(gòu)。
　　4.組織工程化培養(yǎng)模型的建立：取相同密度的MC3T3-E1細(xì)胞接種于兩組支架，在37℃、5％ CO2條件下培養(yǎng)4 h后，加

4、入α-MEM完全培養(yǎng)液，A組為對(duì)照組，B組為實(shí)驗(yàn)組，每2天換1次等量的培養(yǎng)液。
　　5.仿生骨支架材料的細(xì)胞相容性分析：采用MTT和堿性磷酸酶(ALP)法分別檢測(cè)兩組支架細(xì)胞增殖和分化情況，倒置顯微鏡及掃描電鏡（SEM）觀察每組支架表面和內(nèi)部細(xì)胞生長(zhǎng)情況，采用實(shí)時(shí)定量熒光多聚集鏈反應(yīng)（ Real-time PCR）及蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)細(xì)胞特異性基因表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.兩組支架形態(tài)穩(wěn)

5、定，B組比A組支架更為規(guī)整，較符合設(shè)計(jì)的支架模型。
　　2.兩組復(fù)合支架材料均為三維多孔結(jié)構(gòu)，具有一定的孔徑、孔隙率及吸水膨脹率：A組支架孔徑為（163.15±61.93）μm，壁厚為（290.42±71.19）μm，孔隙率為（92.21±2.16）%，吸水膨脹率為（724.09±98.05）%；B組支架大孔徑為（506.37±18.63）μm，小孔徑為（62.14±17.35）μm并存，兩者并存，壁厚為（91.63±18.11）

6、μm，孔隙率為（97.70±1.37）%，吸水膨脹率為（1341.97±64.41）%。A、B組的彈性模量分別為（31.91±11.25）kPa和（340.93±71.98）kPa，A組低于B組（P＜0.05）。X衍射圖譜、紅外光譜以及示差掃描量熱圖顯示A組與B組支架原料的特征性峰值相似，表明蛋白分子結(jié)構(gòu)、分子結(jié)晶度以及分子間作用力并無明顯改變。
　　3.MTT法和ALP活性檢測(cè)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖和分化活性高于對(duì)照組。倒置

7、顯微鏡及掃描電鏡下可見兩組支架表面有大量細(xì)胞粘附生長(zhǎng)，充分伸展，而且實(shí)驗(yàn)組大孔壁上細(xì)胞粘附生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)至21天細(xì)胞可布滿部分孔隙。支架與細(xì)胞共培養(yǎng)21天后，Real-time PCR結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組MC3T3-E1細(xì)胞COLⅠ、ALP及OCN基因的轉(zhuǎn)錄水平高于對(duì)照組（P＜0.05），Western blot結(jié)果表明對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組COLⅠ、ALP及OCN蛋白翻譯水平均良好。
　　結(jié)論：
　　1.兩組支架形態(tài)規(guī)則，均為三維多孔結(jié)

8、構(gòu)。低溫三維打印制備工藝參數(shù)的“個(gè)性化”，使得骨組織工程支架具有可控性的大、小孔徑，可提供更多的細(xì)胞粘附面積。B組支架在孔徑大小、孔隙率、吸水膨脹性及力學(xué)性能等方面優(yōu)于 A組，有利于細(xì)胞養(yǎng)料和代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸。
　　2.低溫三維打印技術(shù)及真空冷凍干燥制備工藝均未破壞復(fù)合骨支架原材料的分子結(jié)構(gòu)與蛋白活性，支架有機(jī)成分與無機(jī)成分的生物活性仍保持不變。
　　3. MC3T3-E1細(xì)胞系接種兩組支架后均能正常生長(zhǎng)增殖，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)、