3D打印β-TCP骨組織工程支架負載異煙肼、利福平-PLGA緩釋微球治療感染性骨缺損的實驗研究.pdf

1、目的：對3D打印β-磷酸三鈣骨組織工程支架負載異煙肼、利福平/PLGA緩釋微球特征、相關力學性能檢測及體內外抗菌能力進行研究。建立兔股骨髁慢性骨髓炎模型，并將復合材料一期置入骨缺損處，觀察其治療效果。創(chuàng)造一種新的治療感染性骨缺損的骨替代材料，這種材料既有較好的局部抗菌能力，又同時可以誘導骨的生長。本研究旨在為慢性骨髓炎的治療尋找一種全新的治療方法，同時也為臨床應用提供實驗依據。
　　方法：本實驗由三部分組成
　　1、3D打印

2、β-磷酸三鈣骨組織工程支架負載異煙肼、利福平/PLGA緩釋微球的制備、特征、相關力學性能檢測及體外抗菌能力研究
　　通過復乳溶劑揮發(fā)法制備異煙肼、利福平/PLGA緩釋微球；采用CAD軟件設計多孔β-磷酸三鈣支架模型，通過3D-Bioplotter打印機制備出多孔β-磷酸三鈣支架；最后采用離心震蕩的方式將緩釋微球載入多孔β-磷酸三鈣支架，制備成復合材料。通過大體觀察、光學顯微鏡及掃描電鏡檢測復合材料的表面情況、孔隙率及微球與支架之間

3、的融合情況；采用抗壓強度測試復合材料的抗壓能力；采用抑菌環(huán)試驗、菌落數(shù)試驗檢測復合材料體外抗菌能力。
　　2、兔股骨髁慢性骨髓炎模型的構建及相關評價
　　在兔股骨髁外側打孔，注入5％的魚肝油酸鈉使局部血管閉塞壞死，而后注入MRSA菌誘導產生慢性骨髓炎模型。進一步探究細菌濃度與慢性骨髓炎之間的關系，總結出最適合的濃度，為以后的實驗提供較理想的動物模型。
　　3、3D打印支架負載緩釋微球治療兔股骨髁慢性骨髓炎的實驗研究

4、r>　　成功建立好股骨髁慢性骨髓炎模型后，對病灶進行徹底外科清創(chuàng)。實驗分為5組，分別為單純清創(chuàng)組、緩釋微球組、支架組、復合材料組、空白對照組。分別于4w、8w、12w進行大體觀察、放射學、組織病理學、免疫組化及細菌培養(yǎng)觀察材料的局部抗菌效果；再通過放射學、MicroCT、免疫組化、PCR觀察材料在局部的成骨效果。
　　結果：1、3D打印β-磷酸三鈣骨組織工程支架負載異煙肼、利福平/PLGA緩釋微球的特征、相關力學性能檢測及體外抗菌

5、能力
　　通過掃描電鏡觀察到支架孔徑大小400μm左右，重量體積法測定孔隙率為(66.34±2.76)%；抗壓強度測試測定材料的最大負荷和強度為114.5±13.8N和5.8±0.7MPa，符合人類松質骨壓縮強度（2-12Mpa）。抑菌實驗表明，復合材料對MRSA有明顯的抗菌能力。
　　2、兔股骨髁慢性骨髓炎模型的構建及相關評價
　　動物分為5組，分別注入A0組（0.1ml生理鹽水）、A1(0.1ml10×106CFU

6、/mlMRSA菌)、A2(0.1ml10×107CFU/mlMRSA菌)、A3(0.1ml10×108CFU/mlMRSA菌)、A4(0.1ml10×109CFU/mlMRSA菌)。術后1w除A0組外各組動物手術部位均出現(xiàn)竇道、流膿和局部腫脹現(xiàn)象；術后4w影像學觀察發(fā)現(xiàn)除A0組均有局部軟組織腫脹，骨皮質變薄，骨小梁數(shù)目減少，骨質硬化，骨質溶解，死骨形成等慢性骨髓炎表現(xiàn)。組織學檢查發(fā)現(xiàn)有大量炎細胞浸潤，取局部組織行細菌培養(yǎng)，菌落生長良好，

7、證實為MRSA菌。對骨髓炎模型進行分級（采用兔金黃色葡萄球菌骨髓炎模型嚴重程度分級）：A1組為0級；A2組為1級；A3組為2～3級；A4組為3～4級。
　　3、3D打印支架負載緩釋微球治療兔股骨髁慢性骨髓炎
　　成功構建慢性骨髓炎動物模型后，將復合材料植入動物骨缺損部位，通過大體觀察、放射學、組織病理學、免疫組化、MicroCT、PCR等檢查發(fā)現(xiàn)只有復合材料組能有效控制慢性骨髓炎的局部炎癥，并且有明顯的成骨作用；影像學觀察發(fā)

8、現(xiàn)炎癥逐漸減輕，骨皮質在材料的作用下開始變連續(xù)，12w后材料開始快速分解，骨質通過孔徑長入；免疫組化發(fā)現(xiàn)在新生骨周圍有大量BMP-2表達，PCR見1型和2型膠原大量表達。其余各組炎癥控制及成骨作用均較差。
　　結論：3D打印β-磷酸三鈣骨組織工程支架負載異煙肼、利福平/PLGA緩釋微球在治療慢性骨髓炎方面具有良好的效果，不僅有滿意的生物相容性和力學強度，而且在局部抗菌和成骨方面具有較大優(yōu)勢。在未來骨髓炎的臨床治療方面，該實驗提供了