骶叢神經(jīng)撕脫傷的臨床治療與實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、由于現(xiàn)代交通與工業(yè)的迅猛發(fā)展，各種高能量創(chuàng)傷導(dǎo)致的骨盆骨折發(fā)生率逐年增加。骶骨骨折或骶髂關(guān)節(jié)脫位等骨盆后環(huán)的不穩(wěn)定損傷極易伴發(fā)骶神經(jīng)損傷，發(fā)生率高達(dá)56.8％。骶叢神經(jīng)損傷可能導(dǎo)致患者下肢運(yùn)動(dòng)及感覺功能障礙，同時(shí)可能出現(xiàn)膀胱及性功能不全。傳統(tǒng)治療手段為保守治療或骨折切開復(fù)位內(nèi)固定及神經(jīng)減壓，但效果不佳，尤其是當(dāng)骶叢神經(jīng)出現(xiàn)根性撕脫傷時(shí)其治療更加困難棘手，長久以來一直是骨科亟待解決的臨床難題。雖然近年有少數(shù)手術(shù)方法修復(fù)骶叢損傷嘗試，但最終

2、僅取得下肢功能少部分恢復(fù)。課題組前期在獼猴的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)切斷腰6（即人類骶1）神經(jīng)根的安全性及健側(cè)腰6神經(jīng)根移位修復(fù)骶叢撕脫傷的有效性，在此基礎(chǔ)上，我們研究了骶1神經(jīng)根在人類下肢主要骨骼肌的神經(jīng)支配情況，發(fā)現(xiàn)骶1神經(jīng)根主要支配臀中肌、臀大肌、股二頭肌、腓骨長肌、腓腸肌內(nèi)側(cè)頭、腓腸肌外側(cè)頭及趾短伸肌，其對(duì)下肢主要骨骼肌的神經(jīng)支配均可通過腰4，腰5，骶2和骶3神經(jīng)根代償，其神經(jīng)支配所占比重最大為腓腸肌外側(cè)頭51.38％。我們最終通過臨

3、床、電生理等多種檢測手段證實(shí)了健側(cè)骶1神經(jīng)根移位修復(fù)單側(cè)骶叢撕脫傷對(duì)健側(cè)肢體的安全性及對(duì)患側(cè)肢體功能恢復(fù)的有效性。
　　另外，課題組前期在對(duì)大鼠骶叢撕脫傷的研究中發(fā)現(xiàn)，脊髓前角神經(jīng)元的死亡是影響修復(fù)效果的主要原因，因此研究脊髓前角神經(jīng)元死亡的機(jī)制，對(duì)于提高脊髓前角神經(jīng)元的存活率，改善骶叢撕脫損傷療效有著關(guān)鍵作用。細(xì)胞死亡主要分為壞死和程序性的細(xì)胞死亡，而程序性細(xì)胞死亡又主要分為兩種，Ⅰ型為細(xì)胞凋亡，Ⅱ型是自噬性細(xì)胞死亡，課題組前期

4、實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)骶叢神經(jīng)撕脫后，脊髓前角神經(jīng)元可發(fā)生明顯凋亡，且脊髓前角神經(jīng)元的凋亡隨時(shí)間上升程度遠(yuǎn)不及其存活率下降程度，分析此過程可能存在自噬等其他細(xì)胞死亡方式。我們通過在體實(shí)驗(yàn)首次明確大鼠骶叢撕脫傷后脊髓前角神經(jīng)元發(fā)生自噬并證實(shí)外源性HMGB1是其發(fā)生的誘因，另外，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重組HMGB1可以誘導(dǎo)脊髓原代神經(jīng)元發(fā)生自噬，HMGB1主要通過ERK和JNK通路對(duì)神經(jīng)元自噬起調(diào)控作用，神經(jīng)元的自噬在氧糖剝奪模擬的損傷環(huán)境下對(duì)其存活起保護(hù)作用

5、。本研究結(jié)果對(duì)骶叢神經(jīng)根性撕脫傷這一病理生理過程提供了更為全面深入的認(rèn)識(shí)，將有望提高骶叢撕脫傷后脊髓前角神經(jīng)元的存活率，最終改善骶叢損傷修復(fù)療效。
　　第一部分 健側(cè)骶1神經(jīng)根移位修復(fù)單側(cè)骶叢神經(jīng)撕脫傷的臨床研究
　　目的:
　　評(píng)估健側(cè)骶1神經(jīng)根作為動(dòng)力源神經(jīng)移位修復(fù)單側(cè)骶叢神經(jīng)撕脫傷的安全性及有效性。
　　方法:
　　本研究納入兩組患者，第一組包括15例骶骨骨折伴有單側(cè)骶叢神經(jīng)損傷的患者，術(shù)前的體格檢查

6、、肌電圖檢查、磁共振及CT檢查均證實(shí)患者健側(cè)下肢的感覺運(yùn)動(dòng)功能完全正常，手術(shù)方法為腰4-骶4椎板減壓及腰骶固定，同時(shí)對(duì)患者健側(cè)的腰4-骶4神經(jīng)根進(jìn)行電刺激，記錄下肢主要骨骼肌的動(dòng)作電勢，明確骶1神經(jīng)根在下肢主要骨骼肌的神經(jīng)支配情況。第二組包括6例單側(cè)骶叢撕脫傷患者，手術(shù)方法為將健側(cè)骶1神經(jīng)根切斷后與患側(cè)臀下神經(jīng)和坐骨神經(jīng)股二頭肌肌支吻合，同時(shí)取患側(cè)的腓總神經(jīng)做神經(jīng)移植。
　　結(jié)果:
　　第一組結(jié)果顯示骶1神經(jīng)根主要參與臀中肌

7、、臀大肌、股二頭肌、腓骨長肌、腓腸肌內(nèi)側(cè)頭、腓腸肌外側(cè)頭及趾短伸肌的神經(jīng)支配，其對(duì)下肢主要骨骼肌的神經(jīng)支配均可通過腰4，腰5，骶2和骶3神經(jīng)根代償，其神經(jīng)支配所占比重最大為腓腸肌外側(cè)頭51.38％。第二組患者在術(shù)后均發(fā)現(xiàn)健側(cè)足底的麻木及肌力的輕度下降，但這些癥狀逐漸消失，健側(cè)肢體的神經(jīng)電生理結(jié)果基本正常，但坐骨神經(jīng)感覺誘發(fā)電位略降低，感覺定量檢測可見患者在骶1神經(jīng)根所支配的皮區(qū)上可見振動(dòng)覺閾值明顯升高，其余感覺未見明顯差異?；紓?cè)髖外展肌

8、力及膝關(guān)節(jié)屈曲肌力增加到Ⅲ級(jí)。
　　結(jié)論:
　　健側(cè)骶1神經(jīng)根移位修復(fù)單側(cè)骶叢神經(jīng)就臨床評(píng)估和電生理檢測結(jié)果來說是安全有效的。因此，骶1神經(jīng)根是治療單側(cè)腰骶叢神經(jīng)撕脫傷的合適動(dòng)力源神經(jīng)。
　　第二部分 大鼠骶叢神經(jīng)撕脫傷后脊髓前角神經(jīng)元自噬表達(dá)及機(jī)制研究
　　目的:
　　1、研究大鼠單側(cè)骶叢撕脫傷后患側(cè)脊髓前角神經(jīng)元的自噬表達(dá)規(guī)律及其與外源性HMGB1關(guān)系。2、研究外源性HMGB1誘導(dǎo)大鼠原代脊髓神經(jīng)元發(fā)生

9、自噬及機(jī)制。3、研究HMGB1誘導(dǎo)自噬在損傷環(huán)境下對(duì)大鼠原代脊髓神經(jīng)元的生物學(xué)意義。
　　方法:
　　1、選用成年雄性SD大鼠30只(體重200-220g)，將其隨機(jī)分為5組，每組6只，首先建立單側(cè)腰4-腰6骶叢撕脫傷模型。分別于損傷后0小時(shí)，4小時(shí)，1天，3天，7天處死后取相應(yīng)節(jié)段脊髓。分別觀察以下指標(biāo):①利用透射電鏡觀察脊髓前角自噬小體等結(jié)構(gòu)。②利用免疫印跡法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ及p62的表達(dá)情況。③利用免疫熒光法

10、檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ及神經(jīng)元特異性標(biāo)記物NeuN的表達(dá)情況。再選用成年雄性SD大鼠10只(體重200-220g)，將其隨機(jī)分為2組，每組5只。A組:撕脫+對(duì)照IgY抗體組，B組:撕脫+HMGB1中和抗體組。A組首先在腹腔內(nèi)注射對(duì)照IgY抗體（2μg/Kg），然后建立單側(cè)腰4-腰6骶叢撕脫傷模型，B組首先在腹腔內(nèi)注射HMGB1中和抗體（2μg/Kg），然后建立單側(cè)腰4-腰6骶叢撕脫傷模型，均于損傷后1天處死取相應(yīng)節(jié)段脊髓。分別觀察以

11、下指標(biāo):①利用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清中HMGB1表達(dá)情況。②利用免疫熒光法檢測相應(yīng)節(jié)段脊髓中HMGB1的表達(dá)情況。③透射電鏡觀察脊髓前角自噬小體等結(jié)構(gòu)。④利用免疫印跡法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ及p62的表達(dá)情況。⑤利用免疫熒光法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ及神經(jīng)元特異性標(biāo)記物NeuN的表達(dá)情況。
　　2、①取培養(yǎng)第7天的SD大鼠原代脊髓神經(jīng)元細(xì)胞，加入重組HMGB1(1μg/ml)，分別于0小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、36小

12、時(shí)和48小時(shí)，利用免疫印跡法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ及p62的表達(dá)情況，利用細(xì)胞免疫熒光法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)情況。②取培養(yǎng)第7天的SD大鼠原代脊髓神經(jīng)元細(xì)胞，加入重組HMGB1(1μg/ml)，分別于0小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)，利用免疫印跡法檢測p-JNK，total-JNK，p-ERK，total-ERK，p-p38的表達(dá)情況。③取培養(yǎng)第7天的SD大鼠原代脊髓神經(jīng)元細(xì)胞首先分別加入SB（10μM）、SP（

13、20μM）和PD(20μM)處理1小時(shí)，然后加入重組HMGB1(1μg/ml)處理36小時(shí)，利用免疫印跡法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)情況。④取培養(yǎng)第7天的SD大鼠原代脊髓神經(jīng)元細(xì)胞，A組:對(duì)照組，B組:HMGB1干預(yù)組，C組:氧糖剝奪干預(yù)組（1小時(shí)或4小時(shí)），D組:HMGB1+氧糖剝奪干預(yù)組（1小時(shí)或4小時(shí)），E組:HMGB1+氧糖剝奪（1小時(shí)或4小時(shí)）+氯喹干預(yù)組。cck-8活力測定檢測神經(jīng)元存活率。
　　結(jié)果:
　　

14、1、單側(cè)骶叢撕脫傷后患側(cè)脊髓前角電鏡下可見大量自噬小體，免疫印跡及免疫熒光檢測均可見自噬相關(guān)蛋白高表達(dá)，撕脫傷后4小時(shí)和1天強(qiáng)度最高。A組血清及脊髓中HMGB1表達(dá)水平顯著高于B組，電鏡觀察可見A組脊髓前角自噬小體數(shù)量大于B組，免疫印跡及免疫熒光檢測均可見A組自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平高于B組。
　　2、重組HMGB1顯著提高原代脊髓神經(jīng)元細(xì)胞的自噬相關(guān)蛋白表達(dá)，處理后36h表達(dá)最高。重組HMGB1激活原代脊髓神經(jīng)元細(xì)胞ERK、JNK和

15、p38 MAPK， ERK和JNK通路阻滯劑可降低自噬相關(guān)蛋白表達(dá)。HMGB1誘導(dǎo)的自噬在氧糖剝奪環(huán)境下提高細(xì)胞存活率，自噬阻滯劑氯喹預(yù)處理后顯著降低細(xì)胞存活率。
　　結(jié)論:
　　單側(cè)骶叢撕脫傷后患側(cè)脊髓前角神經(jīng)元發(fā)生自噬，撕脫傷后4小時(shí)和1天為表達(dá)最高。 HMGB1中和抗體可顯著降低骶叢撕脫傷后患側(cè)脊髓前角神經(jīng)元自噬表達(dá)。重組HMGB1可誘導(dǎo)原代脊髓神經(jīng)元細(xì)胞的自噬表達(dá)，并通過ERK和JNK通路參與自噬調(diào)控。 HMGB1誘