基于血小板活化研究新風(fēng)膠囊對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的作用機(jī)制.pdf

1、1、目的：
　　 以中醫(yī)理論為指導(dǎo),分析、總結(jié)血小板活化在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)發(fā)病中的作用及其中醫(yī)機(jī)制;通過動物實驗,觀察佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis,AA)大鼠血清血小板活化因子(platelet activating factor,PAF),外周血血小板參數(shù)、血小板α顆粒膜糖蛋白(granule membrane protein140,GMP-140)、血小板分

2、化抗原40配體(clus ter of differentiation40 ligand,CD40L),胸腺GMP-140、CD40L、CD40L mRNA,血小板超微結(jié)構(gòu)的變化及體質(zhì)量、足跖腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index,AI)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1、IL-6、IL-17、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、IL-10的變化和健脾益氣中藥新風(fēng)膠囊(Xin

3、feng Capsules,XFC)對AA大鼠的療效及上述指標(biāo)的影響,并基于血小板活化探討XFC對AA大鼠的作用機(jī)制。從而豐富RA“從脾論治,整體調(diào)節(jié)”科學(xué)內(nèi)涵,為中醫(yī)藥治療RA的機(jī)理研究提供新的思路。
　　 2、方法：
　　 2.1、理論研究
　　 通過文獻(xiàn)研究,總結(jié)、分析血小板活化與中醫(yī)血瘀證、RA、中醫(yī)脾虛的關(guān)系。從中醫(yī)理論角度,闡釋RA血小板活化“從脾論治”的機(jī)制。
　　 2.2、實驗研究

4、　　 將40只SD(sprague dawley,SD)雄性大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為5組:正常對照(normal control,NC)組、模型對照(model control,MC)組、雷公藤多甙片(tripterygium wilfordii polyglycoside tablet,TPT)組、甲氨喋呤(methotrexate,MTX)組和XFC組,每組8只,除Nc組外,向每只大鼠右后足跖皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑(freund's c

5、ompleteadjuvant,FCA)0.1 ml致炎,復(fù)制成從大鼠模型,于致炎后第19天開始給予相應(yīng)藥物治療,①TPT組:將TPT研成細(xì)末,加生理鹽水配制混勻,按10 ml/kg灌胃,每天1次。②MTX組:將MTX研成細(xì)末,加生理鹽水配制混勻,按10 ml/kg灌胃,每周1次;未給藥的實驗日,給予生理鹽水灌胃,10 ml/kg,每天1次。③XFC組:將XFC去除膠囊殼研成細(xì)末,加生理鹽水配制混勻,按10 ml/kg灌胃,每天1次。④

6、NC組及MC組予生理鹽水灌胃,10ml/kg,每天1次,連續(xù)用藥30天。實驗過程中觀察各組大鼠的體質(zhì)量、足跖腫脹度、AI。實驗結(jié)束后檢測大鼠各指標(biāo):采用酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked.immunosorbent assay,ELISA)法檢測各組大鼠血清PAF、IL-1、IL-6、IL-17、TNF-α、IL-10的表達(dá),流式細(xì)胞儀檢測大鼠外周血GMP-140、CD40L表達(dá),免疫組化法檢測胸腺CD40L的表達(dá),逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶

7、鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chainreaction,RT-PCR)法檢測胸腺CD40L mRNA的表達(dá),免疫蛋白印跡(western blotting,WB)法檢測胸腺GMP-140的表達(dá),透射電鏡觀察血小板超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　 3、結(jié)果
　　 3.1、理論研究結(jié)果
　　 3.1.1、血小板活化在RA的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用:血小板及其活化產(chǎn)物促進(jìn)了RA滑膜炎癥

8、的發(fā)生與發(fā)展、滑膜組織的增生、血管翳的形成、軟骨及骨破壞。
　　 3.1.2、血小板活化是中醫(yī)血瘀證本質(zhì)的重要表現(xiàn):血瘀證本質(zhì)表現(xiàn)之一為血小板活化,血小板活化參與了血瘀證的發(fā)生與發(fā)展,是血瘀證產(chǎn)生的重要生理、病理基礎(chǔ)。
　　 3.1.3、血瘀證貫穿于RA病程的始終:血瘀在RA發(fā)病過程中既可成為主要的致病因素,又可作為主要的病理機(jī)制而貫穿于整個疾病的始終。
　　 3.1.4、脾虛是RA血瘀證產(chǎn)生的重要因素:脾虛引起

9、的運(yùn)化失職、化源匱乏、脾不統(tǒng)血、陽虛寒凝均可致瘀。
　　 RA血小板活化的中醫(yī)機(jī)制在于脾虛,應(yīng)當(dāng)“從脾論治”。
　　 3.2、實驗研究結(jié)果
　　 3.2.1、AA大鼠血小板參數(shù)、活化指標(biāo)及超微結(jié)構(gòu)的變化:與NC組比較,Mc組AA大鼠血清PAF,外周血PLT、PCT、GMP-140、CD40L,胸腺GMP-140、CD40L、CD40L mRNA表達(dá)顯著升高(P＜0.01),血小板超微結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重。
　　

10、3.2.2、AA大鼠體質(zhì)量、足跖腫脹度、AI的變化:致炎前,各組大鼠的體質(zhì)量比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);給藥前1 d,與NC組相比,MC組大鼠體質(zhì)量明顯減輕(P＜0.05),足跖腫脹度、AI顯著升高(P＜0.01)。
　　 3.2.3、AA大鼠細(xì)胞因子IL-1、IL-6、IL-17、TNF-α、IL-10的變化:與NC組相比,MC組大鼠IL-1、IL-6、IL-17、TNF-α明顯升高(P＜0.01),IL-10顯著

11、降低(P＜0.01)。
　　 3.2.4、AA大鼠血小板活化指標(biāo)與血小板參數(shù)、足跖腫脹度、AI、IL-1、IL-6、IL-17、TNF-α、IL-10的相關(guān)性:從大鼠血清PAF,外周血GMP-140、CD40L,胸腺GMP-140、CD40L、CD40L mRNA與PLT、PCT、IL-1、IL-6、IL-17、TNF-α、足跖腫脹度、AI呈正相關(guān),與IL-10呈負(fù)相關(guān)(P＜0.01或P＜0.05)。
　　 3.2.5、

12、XFG對AA大鼠血小板參數(shù)及活化指標(biāo)的影響:與MC組相比,XFC可以顯著降低AA大鼠血清PAF,外周血PLT、PCT、GMP-140、CD40L,胸腺GMP-140、CD40L、CD40L mRNA的表達(dá)水平(P＜0.01或P＜0.05);與MTX組、TPT組相比,XFC組血清PAF、胸腺GMP-140表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05),外周血GMP-140、胸腺CD40L mRNA呈下降趨勢,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

13、　　 3.2.6、XFG對從大鼠血小板超微結(jié)構(gòu)的影響:XFC組血小板表面伸出細(xì)偽足或小的突起,開放管道細(xì),數(shù)量少,血小板α顆粒較前明顯增多,線粒體大部分完好,少數(shù)腫脹,超微結(jié)構(gòu)較MC組、MTX組、TPT組有所改善。
　　 3.2.7、XFG對AA大鼠體質(zhì)量、足跖腫脹度、AI的影響:XFC組大鼠的體質(zhì)量顯著高于MC組、MTX組及TPT組(P＜0.01或P＜0.05),與NC組無顯著差異(P＞0.05);MTX組、TPT組、XFC

14、組三個治療組AA大鼠足跖腫脹度、AI顯著低于Mc組(P＜0.01),各治療組間相比,足跖腫脹度、AI差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 3.2.8、XFC對細(xì)胞因子IL-1、IL-6、IL-17、TNF-α、IL-10表達(dá)的影響:XFC能夠降低血清IL-1、IL-6、IL-17、TNF-α表達(dá),升高IL-10(P＜0.01),與MTX組、TPT組相比,XFC組IL-10顯著升高(P＜0.05),IL-17呈下降趨勢,但差異

15、無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 4、結(jié)論
　　 4.1、血小板活化在RA的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用,其中醫(yī)機(jī)制在于脾虛,應(yīng)當(dāng)“從脾論治”。
　　 4.2、AA大鼠存在血小板活化,表現(xiàn)為血清PAF,外周血PLT、PCT、GMP-140、CD40L及胸腺GMP-140、CD40L、CD40L mRNA表達(dá)升高。
　　 4.3、AA大鼠血小板活化與炎癥密切相關(guān),表現(xiàn)為血小板活化指標(biāo)PAF、GMP-140、

16、CD40L與致炎因子IL-1、IL-6、IL-17、TNF-α,抑炎因子IL-10及足跖腫脹度、AI具有相關(guān)性。
　　 4.4、XFC對從大鼠體質(zhì)量、足跖腫脹度、AI具有良好的調(diào)控作用。
　　 5、基于血小板活化XFC對AA大鼠的作用機(jī)制
　　 5.1、XFC能通過抑制AA大鼠血小板活化而調(diào)節(jié)細(xì)胞因子在炎癥中的表達(dá),從而降低足跖腫脹度、AI。
　　 5.2、XFC能通過降低從大鼠血清PAF,外周血PLT、