銀杏葉提取物對人牙周膜細胞保護作用的初步研究.pdf

1、銀杏葉為銀杏的干燥葉,其提取物(Ginkgobilobaextract,GBE)及制劑廣泛應用于臨床,具有改善微循環(huán)、擴張心腦血管、抗氧化、清除和抑制氧自由基、抗菌消炎、抗病毒等藥理作用。隨著藥理作用機制的深入研究和藥物提取工藝標準化的提出,銀杏葉的藥用價值在農(nóng)藥、獸藥和醫(yī)藥等多方面得已體現(xiàn),在口腔醫(yī)學領域中也得到越來越廣泛的應用,但其對牙周病的治療機理尚不明確。人牙周膜細胞(Pcriodentalligamentcells,PDLCs

2、)作為牙周組織中的主要功能細胞,具有多向分化潛能,在牙周組織再生修復中發(fā)揮重要作用。
　　 目的:通過觀察GBE對體外培養(yǎng)人PDLCs增殖及其細胞周期的影響以及脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)介導下GBE對人PDLCs分泌細胞因子的影響。從細胞水平證實GBE對人PDLCs的保護作用,并初步探討GBE在牙周病治療中的作用機理,為GBE在牙周病治療方面的應用提供實驗與理論基礎。
　　 方法:本研究分三個

3、部分
　　 實驗一改良組織塊培養(yǎng)法體外培養(yǎng)人牙周膜細胞及其生物學特性觀察。
　　 采用改良組織塊培養(yǎng)法,體外培養(yǎng)PDLCs。常規(guī)蘇木精-伊紅(Haematoxylin-eosinestain,HE)染色進行形態(tài)學觀察,采用免疫組織化學鑒定法鑒定細胞來源。
　　 實驗二銀杏葉提取物對人牙周膜細胞增殖及細胞周期的影響。
　　 1.噻唑藍(methylthiazoliltetracolium,MTT)比色法測定

4、GBE對人PDLCs增殖的影響。取4-7代人PDLCs,用0.25％胰蛋白酶消化后調整細胞濃度為1×104/ml,接種于96孔細胞培養(yǎng)板,培養(yǎng)24h待細胞貼壁后,按實驗分組分別加入含10％胎牛血清(Fetalbovingserum,FBS)及不同濃度GBE的DMEM培養(yǎng)液(Dulbeccominimalessentialmedium,DMEM)(含GBE濃度分別為1、0.1、0.01、0.001mg/ml),對照組為只含10％FBS的D

5、MEM,每組4復孔。分別培養(yǎng)12、24、48、72h后進行MTT檢測。
　　 2.流式細胞儀(FlowCytometry,FCM)測定GBE對人PDLCs細胞周期的影響,按實驗分組分別加入含10％FBS及不同濃度的GBE的DMEM(含GBE濃度分別為0.1、0.01mg/ml),對照組為只含10％FBS的DMEM,分別培養(yǎng)12、24、48、72h后將待測細胞離心-PBS沖洗-固定-離心-沖洗-染色后上機檢測,用細胞增殖指數(shù)(Pr

6、oliferationindex,PrI)表示相對增殖能力。
　　 實驗三銀杏葉提取物對脂多糖介導下人牙周膜細胞生長及分泌細胞因子的影響。
　　 1.觀察不同濃度GBE對LPS介導下PDLCs活性的影響。取生長狀態(tài)良好的第5代人PDLCs,實驗分為五組:對照組、LPS組、LPS+0.1mg/mlGBE組、LPS+0.01mg/mlGBE組、LPS+地塞米松組。對照組為僅含10％FBS的DMEM,LPS終濃度為100μg/

7、ml,地塞米松終濃度為2μg/ml,分別培養(yǎng)12、24、48、72h后,應用MTT比色法測定各組光密度(Opticaldensity,OD)。
　　 2.觀察不同濃度GBE對LPS介導下PDLCs分泌白細胞介素6(Interleukin-6,IL-6)、白細胞介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子α(Tumornecrosisfactoralpha,TNF-α)水平的影響。取生長狀態(tài)良好的第5代人PD

8、LCs,實驗分為五組:對照組、LPS組、LPS+0.1mg/mlGBE組、LPS+0.01mg/mlGBE組、LPS+地塞米松組。對照組為僅含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液,LPS終濃度為100μg/ml,地塞米松終濃度為2μg/ml,分別培養(yǎng)12、24、48、72h后取培養(yǎng)細胞的上清液,保存于-20℃冰箱待檢,按酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzymelinkedimmunosorbentassay,EuSA)檢測試劑盒操作步驟,根據(jù)標準品OD值

9、所得標準曲線,換算所測上清液中IL-6、IL-1β、TNF-α的含量。
　　 結果:
　　 1.原代培養(yǎng)的牙周膜組織塊周圍7天左右可見有梭形細胞游出。經(jīng)免疫組化鑒定:抗細胞角蛋白陰性,抗波形絲蛋白陽性。
　　 2.①MTT結果表明:1mg/mlGBE組對人PDLCs有一定的抑制作用,與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),0.1mg/mlGBE組在12、24、48h對人PDLCs有促進增殖作用,與對照組比較

10、差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),0.01mg/mlGBE組在24、48、72h對人PDLCs有促進增殖作用,與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),0.001mg/ml組對人PDLCs促進作用不明顯,與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。②FCM結果表明:0.1mg/mlGBE組在12、24、48hPrI與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),0.01mg/mlGBE組在24、48、72hPrI與對照組比較差異有統(tǒng)

11、計學意義(P＜0.05)。
　　 3.①MTT結果表明:LPS在濃度為100μg/ml時明顯抑制細胞活性,與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),加入0.1、0.01mg/mlGBE后細胞活性明顯增強,與LPS組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。②ELISA結果表明:LPS在濃度為100μg/ml時明顯促進人PDLCs分泌IL-6、IL-1β、TNF-α的水平,與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),加入

12、0.1、0.01mg/mlGBE均能抑制LPS介導下人PDLCs分泌IL-6、IL-1β、TNF-α的活性,與LPS組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 結論:
　　 1.利用改良組織塊培養(yǎng)法所培養(yǎng)細胞為來源于中胚層的細胞,而非上皮源性。證明本實驗成功培養(yǎng)了人PDLCs,為后續(xù)實驗奠定基礎。
　　 2.①不同濃度的GBE對人PDLCs增殖影響不同,1mg/mlGBE抑制人PDLCs增殖,0.1、0.01

13、mg/mlGBE促進人PDLCs增殖并呈濃度依賴性。②0.1、0.01mg/mlGBE促進體外培養(yǎng)人PDLCs增殖時,使G1期細胞減少,S期細胞增加,細胞增殖指數(shù)PrI值(S+G2/M)％增高,促進更多的細胞進入增殖狀態(tài)。
　　 3.GBE對LPS抑制人PDLCs活性具有保護作用,并且能抑制LPS介導人PDLCs分泌TNF-α、IL-6、IL-1β水平,提示GBE在抗炎作用方面的作用機制與抑制TNF-α、IL-6、IL-1β等炎