銀杏葉提取物對(duì)沙土鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用.pdf

1、臨床上各種原因造成的組織血液灌流量減少可引起缺血性損傷。但在臨床和實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，缺血時(shí)間較長(zhǎng)，盡管未造成組織不可逆損傷，但在恢復(fù)血液灌注時(shí)，組織反而出現(xiàn)比再灌注前更明顯、更顯著的損傷和功能障礙，這種現(xiàn)象被稱(chēng)為缺血一再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)?，F(xiàn)已證明，不同種屬和各種組織器官都可發(fā)生再灌注損傷。探索缺血一再灌注損傷的特點(diǎn)、規(guī)律和發(fā)生機(jī)制，已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)．腦是一個(gè)對(duì)缺血缺氧極敏感的器

2、官，短暫腦缺血即可導(dǎo)致一系列的功能和代謝紊亂。再灌注損傷可以使復(fù)流腦組織神經(jīng)細(xì)胞壞死或凋亡加重，水腫明顯，梗死面積擴(kuò)大，并繼發(fā)血管內(nèi)皮組織細(xì)胞損傷及植物神經(jīng)功能障礙。腦缺血再灌注損傷的病理生理是一個(gè)多環(huán)節(jié)、多因素、多途徑損傷的酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)，作用機(jī)制十分復(fù)雜，這就要求藥物在疾病進(jìn)程中多途徑起作用，或者在疾病發(fā)展過(guò)程中應(yīng)用不同的藥物，以阻止腦缺血后級(jí)聯(lián)反應(yīng)所帶來(lái)的繼發(fā)性腦損傷的發(fā)生。 隨著基礎(chǔ)、臨床研究的不斷深入，人們對(duì)缺血再灌注的

3、認(rèn)識(shí)也不斷加深，但是具體的病理生理機(jī)制尚未完全闡明。一方面，腦缺血再灌注可以挽救瀕臨梗死的細(xì)胞，另一方面則加重細(xì)胞損傷，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。以往對(duì)腦缺血再灌注損傷機(jī)制的研究主要集中在氧自由基，興奮性氨基酸，細(xì)胞內(nèi)鈣超載等方面，近年來(lái)隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)其與炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡也有著密切的關(guān)系，而且各機(jī)制之間還存在著網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系。 銀杏葉提取物(Ginkgo biloba Extracts，EGb761)是從銀杏(Ginkgo bilo

4、ba L．)的葉中利用醇溶液提取出的物質(zhì)，近幾年的研究發(fā)現(xiàn)其具有抗缺血缺氧，增加腦血流量，捕獲自由基，抗血小板活化因子誘導(dǎo)的血小板聚集等作用。但目前對(duì)細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因的調(diào)控作用卻報(bào)道不多。 本實(shí)驗(yàn)利用蒙古沙土鼠(Mongolian gerbil)雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉造成短暫性腦缺血再灌注損傷模型，觀察腦缺血再灌注后超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)的變化及腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，以及EGb761對(duì)

5、其的影響，以明確EGb761對(duì)腦缺血再灌注損傷可能的保護(hù)機(jī)制，為深入探討腦缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制和EGb761的腦保護(hù)作用機(jī)制提供一些有價(jià)值的研究資料。 研究目的： 通過(guò)觀察沙土鼠腦缺血再灌注后組織勻漿中超氧化物歧化酶及過(guò)氧化氫酶活性、丙二醛含量的變化和神經(jīng)細(xì)胞凋亡率，探討銀杏葉提取物對(duì)沙土鼠腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用的可能機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)材料與方法： 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組。 1.1來(lái)源健康成年蒙古沙土

6、鼠，體重60-70克，雌雄兼用，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。 1.2分組按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將88只沙土鼠隨機(jī)分為3組．假手術(shù)組8只、缺血再灌組及EGb761組各40只。根據(jù)缺血再灌注時(shí)間，將缺血再灌組及EGb761組再隨機(jī)分為5個(gè)亞組，分別對(duì)應(yīng)5個(gè)不同的再灌注時(shí)間(3、6、12、24、72小時(shí))，每亞組各8只沙土鼠。其中每組的半數(shù)用于腦組織勻漿液的SOD、CAT及MDA檢測(cè)，另半數(shù)用于凋亡染色。 2.實(shí)驗(yàn)器械、設(shè)備及藥品試劑。

7、 2.1實(shí)驗(yàn)器械、設(shè)備： (1)普通手術(shù)器械一套、手術(shù)操作臺(tái)、烤燈。 (2)光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS)、圖像分析儀(Panasonic)、數(shù)碼相機(jī)(OLYMPUS)。 (3)FSH-Ⅱ型高速電動(dòng)勻漿器。 (4)低速離心機(jī)。 (5)紫外分光光度計(jì)。 (6)數(shù)顯恒溫水浴鍋。 (7)石蠟切片機(jī)。 (8)石蠟包埋機(jī)。 2.2藥品、試劑： (1)10％水合氯醛、

8、生理鹽水注射液、肝素鈉注射液。 (2)4％多聚甲醛。 (3)載玻片、蓋玻片、梯度酒精，二甲苯、蘇木素、中性樹(shù)膠等。 (4)銀杏達(dá)莫注射液。 (5)SOD、CAT及MDA測(cè)定試劑盒。 (6)TUNEL試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺試劑盒。 (7)其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。 3.實(shí)驗(yàn)方法。 3.1模型制備方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用Kirino等沙土鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷模型． 3.2給藥方法對(duì)E

9、Gb761組分別于缺血前30min及缺血后即刻給予銀杏達(dá)莫注射液100mg/kg腹腔內(nèi)注射．假手術(shù)組和缺血再灌組給予等體積生理鹽水。 3.3嚴(yán)格按試劑盒操作步驟測(cè)定腦組織勻漿中SOD、CAT及MDA的含量。 3.4末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(terminaldeoxynucleotidyl transferase-meditated dUTP-nick end labeling，TUNEL)法檢測(cè)凋亡

10、細(xì)胞。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，有3只沙土鼠考慮因麻醉意外死亡，補(bǔ)充3只造模成功沙土鼠，最后進(jìn)入結(jié)果分析的沙土鼠保持為88只。 1.腦組織勻漿液中SOD、CAT及MDA的變化：與假手術(shù)組相比，缺血再灌注后，腦組織勻漿液SOD及CAT活性明顯下降(P<0.05)，MDA濃度顯著升高(P<0.05)。銀杏葉提取物(100mg/kg)使用后腦組織中SOD及CAT含量增加，MDA的含量減少，與模型組比較存在顯著差異(P<

11、0.05)。動(dòng)態(tài)觀察可見(jiàn)：SOD、CAT及MDA的變化從再灌注早期即出現(xiàn)，隨著缺血再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，這種改變更明顯，于再灌24小時(shí)時(shí)腦SOD及CAT減少最為明顯，MDA增加也達(dá)到高峰，此后出現(xiàn)回落。 2.凋亡染色檢測(cè)結(jié)果：假手術(shù)組腦片中CA1區(qū)未出現(xiàn)神經(jīng)元凋亡，腦缺血再灌注早期即3小時(shí)即有凋亡細(xì)胞的表達(dá)。凋亡細(xì)胞陽(yáng)性率隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)進(jìn)行性增高，直至72小時(shí)未見(jiàn)有下降趨勢(shì)，凋亡細(xì)胞主要分布在CA1區(qū)，細(xì)胞變形，濃染，胞核染成