蛻皮甾酮對(duì)沙土鼠短暫前腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用和機(jī)制研究.pdf

1、前言
　　蛻皮甾酮（ecdysterone，簡(jiǎn)寫EDS），是蛻皮類固醇的一種常見衍生物。除了對(duì)無脊椎動(dòng)物有激素作用外，它對(duì)哺乳動(dòng)物也表現(xiàn)出良好的非激素的生物學(xué)作用，例如加強(qiáng)局灶缺血損傷大鼠的血管生成、對(duì)地西泮和乙醇所致小鼠記憶障礙的保護(hù)作用。本文的目的是探討EDS是否對(duì)短暫前腦缺血再灌注損傷(transientglobalforebrainischemia/reperfusion)的沙土鼠有神經(jīng)保護(hù)作用及其作用機(jī)制。
　　短

2、暫前腦缺血再灌注損傷是由雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉術(shù)(BCCAO)造成的，予以同時(shí)夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈5分鐘，隨即再灌注并持續(xù)7天。EDS在沙土鼠腦缺血再灌注后立即腹腔注射，并且在接下來的7天存活時(shí)間里每天給藥1次。
　　在腦缺血再灌注后第7天，通過神經(jīng)功能缺損評(píng)分和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)EDS是否對(duì)腦缺血再灌注損傷的沙土鼠具有提高學(xué)習(xí)及記憶能力的作用。并且通過沙土鼠頸總動(dòng)脈夾閉處血管HE染色觀察，是否BCCAO對(duì)血管造成損傷引起血管狹窄或

3、閉塞，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)誤差。通過Nissl染色和神經(jīng)元核心抗原(neuron-specificprotein/neuronalnuclei，簡(jiǎn)寫NeuN)免疫組化染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行沙土鼠海馬CA1區(qū)各組間對(duì)比有活性神經(jīng)元的數(shù)量變化。進(jìn)一步通過免疫組織化學(xué)染色分析海馬CA1區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GlialFibrillaryAcidicProtein，簡(jiǎn)寫GFAP）陽性細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞特異性蛋白抗體（ion

4、izedcalciumbindingadaptermolecule-1，簡(jiǎn)寫Iba-1）陽性細(xì)胞的數(shù)量。以此觀察沙土鼠短暫前腦缺血-再灌注損傷后海馬CA1區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化的情況，以及EDS治療后對(duì)其的影響。以激光共聚焦免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)觀察GFAP和腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor-α，簡(jiǎn)寫TNF-α)的定位關(guān)系。進(jìn)一步觀察EDS治療后TNF-α的變化情況，觀察是否EDS治療后可以通過影響星形膠質(zhì)細(xì)胞

5、活化情況的變化，從而引起TNF-α這種炎性細(xì)胞因子釋放的變化。通過進(jìn)一步的蛋白印跡法實(shí)驗(yàn)(WesternBlot)檢驗(yàn)?zāi)X缺血再灌注是否引起Caspase-3(cysteineasparticacidspecificprotease-3)表達(dá)的變化及EDS治療對(duì)其的影響。
　　本研究中，我們通過BCCAO法造成沙土鼠短暫前腦缺血-再灌注損傷模型，通過行為學(xué)和形態(tài)學(xué)及分子水平實(shí)驗(yàn)手段觀察:(1)EDS是否對(duì)短暫前腦缺血-再灌注損傷沙土

6、鼠具有減少神經(jīng)功能缺損和提高其學(xué)習(xí)記憶能力的神經(jīng)保護(hù)作用;(2)EDS對(duì)對(duì)短暫前腦缺血-再灌注損傷沙土鼠的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制是否通過其抑制海馬CA1區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，從而減少TNF-α等炎性因子的釋放，導(dǎo)致Caspase-3活化水平的降低，最終通過減少神經(jīng)元的凋亡而實(shí)現(xiàn)的。
　　材料與方法
　　40只3月齡健康雄性蒙古沙土鼠，重量在80±10g，隨機(jī)均分為4組:(1)假手術(shù)組(n=10):常規(guī)BCCAO操作至分離出雙

7、側(cè)頸總動(dòng)脈但并不夾閉，5分鐘后縫合;(2)溶劑對(duì)照組(n=10):BCCAO法造模后每日腹腔注射溶劑;(3)EDS低劑量組(n=10):造模后每日腹腔注射低劑量EDS溶劑;(4)EDS高劑量組(n=10):造模后每日腹腔注射高劑量EDS溶劑。溶劑對(duì)照組和EDS高低劑量組應(yīng)用BCCAO法造成沙土鼠短暫前腦缺血再灌注損傷模型。造模后第2天開始進(jìn)行Morris水迷宮訓(xùn)練。造模第7天進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)后，斷頭處死動(dòng)物取

8、材，半腦固定半腦凍藏，同時(shí)留取頸總動(dòng)脈夾閉段固定。制備沙土鼠半腦和頸總動(dòng)脈冰凍切片。頸總動(dòng)脈進(jìn)行HE染色。半腦切片進(jìn)行Nissl染色、TUNEL染色，以及NeuN、GFAP、Iba-1、TNF-α免疫組織化學(xué)染色和TNF-α與GFAP雙重免疫熒光標(biāo)記的共聚焦實(shí)驗(yàn)。凍藏海馬區(qū)腦組織行Caspase-3的WesternBlot實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)方法統(tǒng)計(jì)切片免疫組化染色結(jié)果。采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件作數(shù)據(jù)處理分析。神經(jīng)功能缺損評(píng)分應(yīng)用

9、多組間均數(shù)比較的非參數(shù)KruskaWalli檢驗(yàn)。Morris水迷宮結(jié)果和其他組化結(jié)果數(shù)據(jù)各組計(jì)量資料均以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，多因素重復(fù)測(cè)量方差分析比較各組之間指標(biāo)變化，組間對(duì)比應(yīng)用t檢驗(yàn)分析，P＜0.01認(rèn)為有顯著性差異。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1、頸總動(dòng)脈HE染色結(jié)果
　　夾閉處頸總動(dòng)脈管壁各層無損傷，未發(fā)現(xiàn)血管狹窄或血栓形成。可以排除由于頸總動(dòng)脈夾閉造成損傷而導(dǎo)致血管狹窄或閉塞，引起永久性缺血，而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)誤差的可能。

10、
　　2、行為學(xué)——神經(jīng)功能缺損評(píng)分和Morris水迷宮
　　EDS高低劑量治療組相比溶劑對(duì)照組，都明顯降低了神經(jīng)功能缺損分?jǐn)?shù)。
　　在造模后第2天和第3天的可視平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中，假手術(shù)組、高劑量組、低劑量組和溶劑對(duì)照組沙土鼠的平均逃避潛伏期及搜索的平均路程呈逐漸下降趨勢(shì)。在造模后第5天到第7天的隱蔽平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中，各組沙土鼠搜索平臺(tái)的潛伏期及找到平臺(tái)所經(jīng)過的路程隨游泳次數(shù)增多呈下降趨勢(shì)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，溶劑對(duì)照組沙土鼠搜索平臺(tái)潛

11、伏期及找到平臺(tái)所經(jīng)過路程與假手術(shù)組沙土鼠相比，二者均明顯延長(zhǎng)，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，而高低治療組的搜索平臺(tái)的潛伏期及找到平臺(tái)所經(jīng)過的路程則明顯低于溶劑對(duì)照組沙土鼠，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在空間探索實(shí)驗(yàn)中，60s內(nèi)對(duì)溶劑照組沙土鼠經(jīng)過相應(yīng)平臺(tái)位置的次數(shù)明顯低于假手術(shù)組，而EDS高低劑量治療組沙土鼠則高于溶劑對(duì)照組。
　　3、Nissl染色結(jié)果
　　與假手術(shù)組對(duì)比，溶劑對(duì)照組海馬CA1區(qū)有活性神經(jīng)元數(shù)目顯著減少。相反，與

12、溶劑對(duì)照組相比，EDS高劑量治療組(50mg/kg)顯著緩解腦缺血損傷引起的尼氏染色陽性細(xì)胞的缺失(P＜0.01)。
　　4、NeuN免疫組織化學(xué)染色結(jié)果
　　NeuN免疫組織化學(xué)染色結(jié)果與尼氏染色的結(jié)果基本一致。與溶劑組相比，EDS治療組能顯著增加NeuN免疫組化陽性細(xì)胞的數(shù)量。
　　5、TUNEL染色結(jié)果
　　假手術(shù)組沙土鼠在海馬CA1區(qū)僅見少量TUNEL陽性反應(yīng)細(xì)胞;短暫前腦缺血-再灌注7dayEDS治療組

13、沙土鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞內(nèi)呈深棕色的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目明顯較溶劑對(duì)照組減少。溶劑對(duì)照組海馬CA1區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)與EDS治療組之間比較有顯著性差異(P＜0.01)。
　　6、GFAP和Iba-1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果
　　腦缺血后，沙土鼠海馬CA1區(qū)GFAP和Iba-1免疫組織化學(xué)陽性細(xì)胞顯著增多，而EDS治療后，卻相應(yīng)減少。
　　7、TNF-α免疫組織化學(xué)染色結(jié)果
　　溶劑對(duì)照組TNF-α免疫組織化學(xué)

14、陽性細(xì)胞的數(shù)量較假手術(shù)組顯著增加，應(yīng)用EDS治療后可以明顯減少。
　　8、激光共聚焦染色結(jié)果
　　雙重免疫熒光標(biāo)記顯示TNF-α免疫陽性細(xì)胞同時(shí)對(duì)抗GFAP抗體呈陽性反應(yīng)。
　　9、Westernblot檢測(cè)Caspase-3蛋白表達(dá)結(jié)果
　　應(yīng)用EDS治療后有活性的Caspase-3表達(dá)水平較溶劑對(duì)照組顯著下降。
　　討論
　　在本研究中，通過BCCAO法造成沙土鼠短暫前腦缺血-再灌注損傷模型，應(yīng)用

15、EDS治療后與溶劑對(duì)照組比較，通過行為學(xué)、形態(tài)學(xué)和分子水平實(shí)驗(yàn)研究EDS的神經(jīng)保護(hù)作用及其作用機(jī)制。
　　通過神經(jīng)功能缺損評(píng)分，我們觀察到:短暫前腦缺血再灌注損傷后，溶劑對(duì)照組沙土鼠較假手術(shù)組動(dòng)物表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)功能缺損，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而EDS治療后則可明顯緩解這種神經(jīng)功能缺損。進(jìn)一步通過Morris水迷宮的定位巡航實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)，我們證實(shí)EDS對(duì)沙土鼠前腦缺血-再灌注損傷后學(xué)習(xí)記憶能力的下降具有明顯的治療作用。由于學(xué)習(xí)與

16、記憶的完成主要需要海馬區(qū)神經(jīng)元的支配作用，通過對(duì)海馬CA1區(qū)各組間Nissl染色和NeuN免疫組化染色觀察活性神經(jīng)元的數(shù)量、TUNEL染色觀察凋亡神經(jīng)元的情況，我們知道EDS的神經(jīng)保護(hù)作用可能是通過減少神經(jīng)元的凋亡、保留活性神經(jīng)元的數(shù)量而實(shí)現(xiàn)的。
　　由短暫前腦缺血再灌注損傷引起的TNF-α釋放增多，通過EDS(20mg/kg和50mg/kg)治療得到了明顯改善。由這些結(jié)果可推斷出EDS發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用是通過其抗炎癥反應(yīng)的特性而發(fā)

17、揮的。通過激光共聚焦免疫熒光實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論，在TNF-α和GFAP的組織化學(xué)免疫陽性細(xì)胞共定位。GFAP作為星形膠質(zhì)細(xì)胞的特征性標(biāo)志物與這TNF-α這種炎性因子共定位說明，前腦缺血引起星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，使其大量釋放TNF-α。我們的研究證實(shí)前腦缺血再灌注損傷后，沙土鼠海馬CA1區(qū)Iba-1陽性細(xì)胞數(shù)量和GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，說明小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞在缺血后活化。雖然星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞在缺血后以相似的模式活化，它們不但發(fā)揮

18、不同的作用，而且在缺血后不同的時(shí)間階段和區(qū)域發(fā)揮作用。小膠質(zhì)細(xì)胞較星形膠質(zhì)細(xì)胞更早地釋放IL-1β和TNF-α，以至于我們還沒有通過實(shí)驗(yàn)觀察到這個(gè)過程就結(jié)束了。而EDS可以減少前腦缺血-再灌注損傷后海馬CA1區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，而進(jìn)一步減少TNF-α的表達(dá)，從而抑制炎癥反應(yīng)。但是，我們還不清楚EDS發(fā)揮抗炎癥反應(yīng)的作用，是單獨(dú)通過其抗氧化能力還是通過抑制膠質(zhì)細(xì)胞活化而發(fā)揮的。
　　腦缺血損傷后，發(fā)生相應(yīng)部位為主的氧化

19、應(yīng)激反應(yīng)和/或線粒體功能紊亂，最終導(dǎo)致凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活，引起神經(jīng)損傷。Caspase全稱為含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，是一類蛋白酶家族，具有類似的結(jié)構(gòu)并存在于細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)和執(zhí)行中都發(fā)揮重要作用。Caspase有兩類，起始Caspase在凋亡刺激物的作用下被切割激活，其對(duì)執(zhí)行Caspase進(jìn)行切割使其激活，然后通過對(duì)Caspase靶蛋白的水解最終導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡。在已被人們發(fā)現(xiàn)的10余種Caspase中，Caspase

20、-3在細(xì)胞凋亡中起著不可替代的作用。Pro-Caspase-3在活化過程中被剪切成兩種亞基后再組成具有活性形式的Caspase-3而進(jìn)而引起凋亡。大量的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)腦缺血后引起Caspase-3的上調(diào)。我們的實(shí)驗(yàn)也得出結(jié)論，前腦缺血再灌注損傷后，通過EDS治療不但可以明顯降低沙土鼠海馬CA1區(qū)Caspase-3的表達(dá)，而且可以抑制它的活化，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用。
　　結(jié)論
　　1、BCCAO方法造成沙土鼠短暫前腦缺血-再灌

21、注損傷模型未對(duì)血管造成副損傷。
　　2、EDS可明顯減少短暫前腦缺血-再灌注損傷沙土鼠的神經(jīng)功能缺損。
　　3、EDS可顯著改善短暫前腦缺血-再灌注損傷沙土鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的障礙。
　　4、EDS可以減少由短暫前腦缺血-再灌注損傷引起的沙土鼠海馬CA1區(qū)遲發(fā)性神經(jīng)元凋亡，從而增加存活正常功能神經(jīng)元的數(shù)量。
　　5、EDS可以抑制由短暫前腦缺血-再灌注損傷引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，從而抑制炎癥反應(yīng)。<