小續(xù)命湯對急性腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護作用及機制研究.pdf

1、本文從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 小續(xù)命湯對急性腦缺血再灌注損傷的總體作用及對血腦屏障的保護作用研究
　　目的:通過建立腦缺血再灌注損傷模型，探討小續(xù)命湯對急性腦缺血再灌注損傷的總體作用及對血腦屏障的保護作用。
　　方法:將120只SPF級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠隨機分為5組，分別為假手術組(Sham)，腦缺血再灌注組(IR)，腦缺血再灌注+小續(xù)命湯低劑量組(15g/kg/day)(XXM

2、D15)，腦缺血再灌注+小續(xù)命湯中劑量組(30 g/kg/day)(XXMD30)，腦缺血再灌注+小續(xù)命湯高劑量組(60 g/kg/day)(XXMD60)。采用左側(cè)大腦中動脈阻塞(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)法建立局灶性腦缺血再灌注損傷模型。腦缺血再灌注24 h后進行2，3，5-triphenyltetrazolium chloride(TTC)染色，根據(jù)TTC染色計算腦梗死面積及半球腫

3、脹;實驗各組腦缺血病理性損害通過再灌注24h后hematoxylin-eosin(HE)染色進行評估;于不同時間點觀察各組大鼠的行為學改變;再灌注24 h后透射電鏡觀察血腦屏障亞顯微結(jié)構(gòu)的變化。通過測定腦含水量、伊文思藍滲出量評估腦水腫形成及血腦屏障通透性改變。免疫組織化學染色、western blot檢測急性腦缺血再灌注后MMP-9，MMP-2及VEGF的表達變化。
　　結(jié)果:與腦缺血再灌注模型組比較，小續(xù)命湯中、高劑量(30/

4、60 g/kg/day)治療可顯著縮小急性腦缺血再灌注導致的腦梗死面積和半球腫脹，明顯減輕缺血性病理改變，顯著改善模型動物的行為學表現(xiàn)。小續(xù)命湯(60 g/kg/day)治療可明顯減少腦含水量、伊文思藍滲出量，保護血腦屏障的亞顯微結(jié)構(gòu)。另外我們還發(fā)現(xiàn)小續(xù)命湯(60 g/kg/day)治療可顯著下調(diào)腦缺血再灌注后MMP-9，MMP-2及VEGF的表達。
　　結(jié)論:小續(xù)命湯對急性腦缺血再灌注損傷有一定的神經(jīng)保護作用，60 g/kg/d

5、ay是小續(xù)命湯治療急性腦缺血再灌注損傷的最佳療效劑量。小續(xù)命湯(60 g/kg/day)可從結(jié)構(gòu)、功能上減輕腦缺血再灌注損傷導致的血腦屏障破壞，可能與下調(diào)MMP-9，MMP-2及VEGF的表達有關。
　　第二部分 小續(xù)命湯對急性腦缺血再灌注神經(jīng)血管單元的保護作用及機制研究
　　目的:通過建立腦缺血再灌注損傷動物模型，探討小續(xù)命湯對急性腦缺血再灌注神經(jīng)血管單元的保護作用及相關機制。
　　方法:將106只SPF級雄性SD大

6、鼠隨機分為5組，分別為假手術組(Sham)、腦缺血再灌注模型組(I/R、腦缺血再灌注+小續(xù)命湯治療組(60 g/kg/day)(XXMD60)，腦缺血再灌注+小續(xù)命湯治療+LY294002組(XXMD60+LY294002)，腦缺血再灌注+小續(xù)命湯治療+Vehicle組(XXMD60+Vehicle)。小續(xù)命湯治療組術前3d開始連續(xù)灌胃給予相應體積的小續(xù)命湯至觀察時間節(jié)點。采用左側(cè)大腦中動脈線栓法建立腦缺血再灌注損傷模型。XXMD60+

7、LY294002、XXMD60+Vehicle組在腦缺血誘導前30 min側(cè)腦室給予10μl10 mM LY294002或Vehicle。腦缺血90 min再灌注24h后進行神經(jīng)功能缺損評分，TTC染色評價實驗各組腦梗死面積。再灌注24 h后Nissl染色評估實驗各組缺血皮層半暗帶區(qū)的完整細胞數(shù)。再灌注24 h后TUNEL染色聯(lián)合免疫熒光法標記不同的細胞標記物(NeuN、GFAP、CD31)以檢測實驗各組缺血皮層半暗帶區(qū)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)

8、細胞、血管內(nèi)皮細胞的凋亡情況。Westernblot檢測各組急性腦缺血再灌注后PI3K/Akt通路相關蛋白的表達。
　　結(jié)果:與腦缺血再灌注模型組比較，小續(xù)命湯(60 g/kg/day)可顯著促進急性腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)功能恢復，減少腦梗死面積，促進缺血半暗帶區(qū)細胞的存活，而PI3K抑制劑可阻斷小續(xù)命湯的保護作用。TUNEL及免疫熒光結(jié)果提示小續(xù)命湯可顯著減少神經(jīng)血管單元多種類型細胞凋亡，PI3K抑制劑可阻斷小續(xù)命湯的多靶點抗凋

9、亡作用。Western blot結(jié)果顯示小續(xù)命湯顯著上調(diào)p-PDK1(Ser241)，p-PTEN(Ser380)，p-Akt(Ser473)，p-GSK3β(Ser9)及p-c-Raf(Ser259)蛋白的表達，PI3K抑制劑與小續(xù)命湯聯(lián)用時可破壞小續(xù)命湯對p-PDK1(Ser241)，p-Akt(Ser473)，p-GSK3β(Ser9)蛋白表達的影響，而不能阻斷p-PTEN(Ser380)，p-c-Raf(Ser259)蛋白的表達

10、上調(diào)。
　　結(jié)論:小續(xù)命湯治療(60 g/kg/day)可抑制急性腦缺血再灌注導致的神經(jīng)血管單元多種類型細胞凋亡，該保護作用可能與激活的PI3K/Akt信號通路相關。
　　第三部分 小續(xù)命湯對急性腦缺血再灌注線粒體的保護作用及機制研究
　　目的:本部分研究旨在通過建立腦缺血再灌注損傷動物模型，探討小續(xù)命湯對急性腦缺血再灌注線粒體的保護作用及相關機制。
　　方法:將85只SPF級雄性SD大鼠隨機分為假手術組(Sha

11、m)、腦缺血再灌注組(I/R)、腦缺血再灌注+小續(xù)命湯治療組(60g/kg/day)(XXMD60)，共三組。小續(xù)命湯治療組從術前3d開始連續(xù)灌胃給予相應體積的小續(xù)命湯至實驗結(jié)束，而假手術組及腦缺血再灌注組給予相應體積的雙蒸水。腦缺血再灌注損傷由左側(cè)大腦中動脈線栓法誘導。腦缺血再灌注24 h后透射電鏡觀察急性腦缺血再灌注后實驗各組線粒體的形態(tài)改變。再灌注24 h后TUNEL染色聯(lián)合cleaved caspase3免疫組織化學染色檢測腦缺

12、血皮層半暗帶區(qū)的細胞凋亡。將新鮮腦組織分離提取線粒體蛋白、胞漿蛋白部分，首先進行純化驗證，免疫熒光染色聯(lián)合western blot觀察急性腦缺血再灌注后p53蛋白在線粒體的表達及p53蛋白的線粒體轉(zhuǎn)位，并用western blot檢測急性腦缺血再灌注后線粒體p53通路相關蛋白的表達。
　　結(jié)果:小續(xù)命湯治療(60 g/kg/day)可明顯減輕急性腦缺血再灌注導致的線粒體形態(tài)改變。與模型組比較，小續(xù)命湯可顯著抑制缺血皮層半暗帶區(qū)神經(jīng)

13、細胞凋亡。另外，小續(xù)命湯可顯著下調(diào)p53蛋白在線粒體的表達，減少p53蛋白的線粒體轉(zhuǎn)位及線粒體Bax蛋白表達水平，上調(diào)線粒體部分Bcl-2蛋白的表達，減少cytochromec，Smac/Diablo蛋白從線粒體的釋放，抑制胞漿部分caspase9，caspase3的活化，并上調(diào)c-IAP1的表達。
　　結(jié)論:小續(xù)命湯治療(60g/kg/day)可明顯保護急性腦缺血再灌注后線粒體的形態(tài)，抑制細胞凋亡，減少線粒體p53表達和p53線