氯碘羥喹對沙土鼠全腦缺血再灌注后鋅離子致神經(jīng)元死亡的保護作用及其機制.pdf

1、金屬鋅是人體內含量第二位的過渡金屬元素，也是正常生長發(fā)育、基因表達、蛋白質代謝、免疫功能等過程中所必需的元素。在嚙齒類動物中，短暫的全腦缺血可以使海馬CA1區(qū)的錐體細胞出現(xiàn)延遲性神經(jīng)元死亡。有證據(jù)顯示大腦局部缺血中風的大鼠皮層中出現(xiàn)了鋅離子從突觸前神經(jīng)元“涌入”突觸后神經(jīng)元的現(xiàn)象。在短暫全腦缺血后神經(jīng)元軸突終末釋放的過量鋅離子可能是導致腦選擇性延遲神經(jīng)元死亡的重要原因之一。許多研究表明在缺血動物模型體內注射鋅離子螯合劑對缺血所致的神經(jīng)功

2、能障礙有保護作用。例如，在全腦缺血模型中給予鋅離子螯合劑Ca—EDTA可以顯著的減少神經(jīng)元死亡，在蒙古沙土鼠全腦缺血模型給予Ca—EDTA可以減輕CA1區(qū)神經(jīng)元的損傷。氯碘羥喹(Clioquinol，CQ，5—氯—7—碘—8—羥喹，分子量：305.5)是一種具有膜通透性和疏水性的鋅離子螯合劑，能穿過血腦屏障。本研究通過制作沙土鼠全腦缺血模型并給予CQ，探討CQ對海馬CA1區(qū)錐體細胞的保護作用及其機理。 材料與方法: 一、

3、實驗動物及分組 健康成年2月齡蒙古沙土鼠隨機分為3組：(1)假手術對照組；(2)腦缺血溶劑對照組(1d，3d，7d)；(3)腦缺血CQ治療組(1d，3d，7d)。二甲基亞砜(DMSO)作為CQ的溶劑。 為了驗證CQ有螯合鋅離子的作用，正常2月齡沙土鼠隨機分為兩組：(1)正常組；(2)注射CQ2小時組。用硒化鋅金屬自顯影(autometallography，AMG)法檢測CQ對鋅離子的螯合作用。 二、沙土鼠全腦缺血

4、模型的建立 沙土鼠用4％戊巴比妥鈉麻醉(40mg/kg，ip)，頸部正中切口游離迷走神經(jīng)纖維暴露雙側頸總動脈，用無創(chuàng)動脈夾阻斷雙側頸總動脈(假手術對照組不夾閉)，造成全腦缺血，夾持10min后松開動脈夾，見雙側頸總動脈血液充盈，雙側頸總動脈重新恢復供血。頸部切口用4號尼龍線縫合，酒精消毒。術后沙土鼠在加熱燈照射下保溫2h直至復蘇。腦缺血溶劑對照組在術后立即腹腔注射溶劑DMSO(10mg/kg/day)，腦缺血CQ治療組在術后立即

5、腹腔注射CQ溶液(10mg/kg/day)，按照1d，3d，7d的時間點取材。 三、檢測指標: 應用硒化鋅金屬自顯影AMG法和TSQ鋅離子熒光染色檢測CQ螯合鋅離子的作用。應用Nissl染色檢測腦缺血后溶劑對照組和CQ治療組之間海馬CA1區(qū)錐體細胞的丟失情況。采用TUNEL染色檢測腦缺血3d CQ是否有對腦缺血后CA1區(qū)錐體細胞的保護作用。采用原位雜交來檢測腦缺血3d各組Caspase—3和Caspase—9的mRNA的

6、表達變化。采用Western Blot來檢測在腦缺血1d、3d和7d各組之間Caspase—3和凋亡誘導因子(apoptosis inducing factor，AIF)的蛋白含量的變化的情況。 實驗結果: 一、硒化鋅AMG染色結果 在注射鋅離子螯合劑CQ的正常沙土鼠標本切片中可在整個海馬區(qū)域見AMG陽性反應與未注射鋅離子螯合劑的沙土鼠標本切片相比染色減弱，在齒狀回和苔蘚纖維處的陽性反應也與未注射鋅離子螯合劑CQ

7、沙土鼠切片相比較減弱。 二、TSQ鋅離子熒光染色結果 熒光顯微鏡下觀察，在沙土鼠海馬苔蘚纖維和齒狀回部位腦缺血3d后TSQ熒光染色較假手術對照組增強，而注射了鋅離子螯合劑CQ的沙土鼠TSQ熒光染色較假手術組和溶劑對照組相比最弱。 三、海馬CA1區(qū)Nissl染色結果及CA1區(qū)神經(jīng)元計數(shù) 假手術對照組沙土鼠海馬CA1區(qū)未見明顯神經(jīng)元損害性改變。腦缺血1d，3d，7d溶劑對照組沙土鼠海馬CA1區(qū)可見顯著的錐體細

8、胞變性、壞死。與溶劑對照組相比，腦缺血1d，3d，7d CQ治療組海馬CA1區(qū)錐體細胞死亡數(shù)目減少，錐體細胞較排列，形態(tài)較完整。 四、TUNEL染色結果 假手術對照組沙土鼠在海馬CA1區(qū)僅見少量TUNEL陽性反應細胞；腦缺血3d CQ治療組沙土鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞內呈深棕色的TUNEL陽性細胞數(shù)目明顯較溶劑對照組減少。腦缺血3d溶劑對照組海馬CA1區(qū)TUNEL陽性細胞數(shù)與CQ治療組之間比較有顯著性差異(P<0.01)。

9、 五、Caspase—3和Caspase—9原位雜交染色結果 光鏡下見Caspase—3和Caspase—9原位雜交陽性反應產(chǎn)物均呈深棕黃色。假手術對照組沙土鼠海馬CA1區(qū)僅見少量Caspase—3和Caspase—9原位雜交陽性反應細胞。腦缺血3d CQ治療組沙土鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞內呈深棕黃色的Caspase—3和Caspase—9原位雜交陽性細胞數(shù)量明顯減少。腦缺血3d溶劑對照組海馬CA1區(qū)Caspase—3和C

10、aspase—9原位雜交陽性細胞數(shù)與CQ治療組之間比較有顯著性差異(P<0.01)。 六、Caspase—3和AIF的Western blot結果 腦缺血術后1d，3d，7d的溶劑對照組Caspase—3和AIF在動物海馬的表達高于CQ治療組動物。其中Caspase—3(17KD)溶劑對照組和CQ治療組相比，在1d、3d、7d時間點各組(P<0.01)；Procaspase—3(32KD)溶劑對照組和CQ治療組相比，在1

11、d、7d時間點(P<0.05)，在3d時間點(P<0.01)；AIF(67KD)溶劑對照組和CQ治療組相比，在1d時間點(P<0.01)，在3d、7d時間點(P<0.05)。 結論: 1、應用AMG染色和TSQ熒光技術證實CQ對鋅離子具有螯合作用。 2、腦缺血后1d、3d和7d CQ治療組CA1區(qū)錐體細胞數(shù)目較溶劑對照組增多。TUNEL染色證實在腦缺血后3d CQ治療組CA1區(qū)錐體細胞TUNEL陽性細胞數(shù)目較溶劑