逐步pH靶向性口服納米藥物載體的制備及體內(nèi)外表征.pdf

1、化療藥物已經(jīng)廣泛用于癌癥臨床治療，實(shí)驗(yàn)表明它能有效地抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但其較差的溶解性和吸收率以及復(fù)雜的生理屏障會(huì)嚴(yán)重影響藥物對(duì)體內(nèi)腫瘤的治療效果。此外，臨床上藥物進(jìn)入機(jī)體主要通過(guò)口服或者靜脈的方式，這兩種方式均存在對(duì)應(yīng)的缺陷。因此需要利用藥物載體包載藥物后再送入機(jī)體，保證在特定條件下釋放藥物，以避免藥物所產(chǎn)生的系統(tǒng)毒性。研究人員針對(duì)口服給藥和靜脈給藥設(shè)計(jì)了一系列的藥物載體，例如胃腸道靶向吸收的口服藥物載體，納米藥物傳遞載體

2、(Nano-DDS)，它們能夠起到較好的效果。并且這兩種給藥方式都有相應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)，例如口服給藥方便簡(jiǎn)單，生物安全性高;靜脈給藥能達(dá)到最高的絕對(duì)生物利用度（Absolute bioavailability,AB），藥物發(fā)揮作用更快。但僅針對(duì)口服或靜脈給藥單方面進(jìn)行改良的藥物載體，都有一些無(wú)法避免的缺點(diǎn):口服給藥會(huì)造成極強(qiáng)的首過(guò)效應(yīng)，最終導(dǎo)致更低的AB和更高的藥物毒性;靜脈注射的給藥方式會(huì)破壞皮膚且給藥后藥物濃度瞬間變化，可能引起較大的給藥風(fēng)

3、險(xiǎn)，對(duì)應(yīng)的給藥生物安全性低。此外，由于口服給藥體系和靜脈注射體系存在明顯的pH梯度。因此可以通過(guò)設(shè)計(jì)一種具逐步pH靶向性的藥物載體來(lái)整合靜脈注射和口服給藥的優(yōu)點(diǎn)以盡可能改善二者的缺點(diǎn)。
　　本文擬制備一種具有雙層結(jié)構(gòu)的口服納米藥物載體，外層為羧甲基殼聚糖(CMC)涂層，它能在胃部強(qiáng)酸環(huán)境中保護(hù)內(nèi)部載藥核心不被降解，最大程度上避免藥物傷害胃腸道;并且在腸道內(nèi)CMC涂層靶向小腸上皮細(xì)胞并打開緊密連接（Tight junctions，T

4、Js）來(lái)促進(jìn)吸收。內(nèi)部為疏水核心包括聚（原酸酯-氨酯）P(OE-HMDI-CL)和化療藥物，它能保證該藥物載體被吸收進(jìn)入血液后長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定循環(huán)，隨后通過(guò)實(shí)體瘤的高通透性和滯留(EPR)效應(yīng)的被動(dòng)靶向達(dá)到高效富集。最終癌細(xì)胞的微酸環(huán)境觸發(fā)原酸酯鍵斷裂，藥物載體崩解使得藥物在癌癥細(xì)胞內(nèi)快速富集，擬實(shí)現(xiàn)在高效地殺滅癌癥細(xì)胞的同時(shí)降低系統(tǒng)毒性。
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在溫和條件下分步聚合的方式，將酸敏感性的二羥基原酸酯單體(OEOH)和高疏水性的聚

5、己內(nèi)酯(PCL)等比例地引入聚（原酸酯-氨酯）。核磁氫譜(NMR)和凝膠滲透色譜(GPC)表征結(jié)果表明該聚合物被成功合成并且分子量(Mn=1.81×104)適中。接著通過(guò)常用的水包油超聲乳化法制備不同的納米微球:分別用聚乙烯醇(PVA)或CMC來(lái)制備單層納米微球（對(duì)照組）或雙層納米微球，對(duì)應(yīng)命名為NP1和NP2。通過(guò)透射電鏡(TEM)和掃描電鏡(SEM)觀察到NP1和NP2的微觀形貌，成功證明NP2為雙層結(jié)構(gòu)。動(dòng)態(tài)光衍射(DLS)檢測(cè)表

6、明NP1和NP2的水合粒徑分別為196.3nm和359.8nm。通過(guò)傅立葉紅外光譜儀(FT-IR)和NMR表征，以及觀察NP1和NP2的離子緩沖能力，發(fā)現(xiàn)NP2為NP1和CMC的混合物，并且CMC位于NP2的外部。
　　然后通過(guò)模擬不同生理環(huán)境的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證納米微球的穩(wěn)定性。首先，將NP1和NP2分別與體外強(qiáng)酸環(huán)境(pH=1.0)和胃部模擬液孵育一段時(shí)間后，發(fā)現(xiàn)了完全不同的狀況。NP1懸浮液由于原酸酯鍵快速斷裂，納米微球崩

7、解導(dǎo)致溶液很快就出現(xiàn)沉淀，而NP2懸浮液卻能穩(wěn)定存在，有極強(qiáng)的耐受強(qiáng)酸性。隨后，在體內(nèi)驗(yàn)證NP2的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)高劑量的NP2通過(guò)口服的方式送入小鼠體內(nèi)后，能在小鼠血清中觀察到穩(wěn)定的納米微球結(jié)構(gòu)，表明NP2能以藥物載體的形式穿過(guò)小腸間隙，并且無(wú)明顯的降解現(xiàn)象。
　　作為理想化的口服藥物載體，極好的生物相容性和生物安全性是必不可少的。MTT實(shí)驗(yàn)表明NP1和NP2均不會(huì)對(duì)NIH/3T3細(xì)胞的生長(zhǎng)造成任何抑制效果，各種不同濃度的納米微球與

8、細(xì)胞孵育后存活率均能到達(dá)95％以上。對(duì)小鼠口服不同劑量納米微球的急性毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)即使在超高劑量的NP1或NP2(2000mg/kg)灌胃后，小鼠均正常增長(zhǎng)。即使在攝入納米微球14天后，小鼠的血漿生化指標(biāo)也均無(wú)異常且對(duì)小鼠主要器官也無(wú)顯著毒性。
　　本實(shí)驗(yàn)旨在盡可能改善游離阿霉素(Free DOX)所產(chǎn)生的嚴(yán)重心臟毒性，因此將DOX制備成一種口服納米藥物載體，分別命名為NP1/DOX和NP2/DOX。通過(guò)計(jì)算發(fā)現(xiàn)，NP1/DOX和N

9、P2/DOX的載藥率(DLC)分別為14.32％和17.27％，表明NP1和NP2均能高效地負(fù)載藥物。在體外模擬體內(nèi)環(huán)境進(jìn)行藥物釋放研究，結(jié)果表明載藥納米微球均能在低pH(5.0)條件下穩(wěn)定地進(jìn)行藥物釋放;而在強(qiáng)酸條件(pH=1.0)下，僅有NP2/DOX能長(zhǎng)時(shí)間保持藥物不被釋放。
　　相對(duì)較高的口服AB和合理的藥物分布是作為口服藥物載體的重中之重，本實(shí)驗(yàn)就free DOX、NP1/DOX和NP2/DOX的口服AB進(jìn)行研究，同時(shí)設(shè)

10、定靜脈注射劑量為6mg/kg free DOX的AB為100％。結(jié)果表明小鼠灌胃10mg/kg劑量的NP2/DOX后所達(dá)到的AB是75.4％，這分別是free DOX和NP1/DOX在相同劑量條件下口服AB的3.83和2.77倍，表明該雙層納米藥物載體能顯著提高DOX的口服AB。同樣對(duì)3種不同藥物配方給藥后的藥物分布情況進(jìn)行測(cè)定，研究發(fā)現(xiàn)在口服free DOX和NP1/DOX后心臟內(nèi)DOX的富集量較高，其最大值均超過(guò)了4μg/g tis

11、sue，這將會(huì)帶來(lái)極大的風(fēng)險(xiǎn)，但相反腫瘤組織內(nèi)DOX的含量卻很低。而NP2/DOX組卻有不同的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，在口服該藥物劑型后心臟內(nèi)DOX的濃度一直都未超過(guò)1.6μg/g tissue;且腫瘤組織內(nèi)DOX的濃度相對(duì)于其他不同的劑型藥是最高的，最大值接近于8μg/g tissue。這是由于NP2/DOX可以以藥物載體的形式進(jìn)入血液，然后通過(guò)EPR效應(yīng)被動(dòng)靶向腫瘤組織以達(dá)到高效富集。
　　最后，通過(guò)體內(nèi)實(shí)體瘤的抑制效果和治療過(guò)程中對(duì)器官的

12、損傷情況對(duì)該藥物載體的實(shí)際體內(nèi)性能進(jìn)行評(píng)估。本實(shí)驗(yàn)首先建立肝癌(H22)小鼠模型，然后采用劑量為10mg/kg的free DOX，NP1/DOX，NP2/DOX進(jìn)行連續(xù)口服治療，此期間選取生理鹽水(Saline)，NP1和NP2作為陰性對(duì)照組。研究發(fā)現(xiàn)各個(gè)陰性對(duì)照組即使在連續(xù)灌胃7天后均無(wú)明顯區(qū)別，進(jìn)一步驗(yàn)證了納米微球具備優(yōu)異的生理相容性。雖然free DOX和NP1/DOX組相比于陰性對(duì)照組對(duì)腫瘤組織有一定的生長(zhǎng)抑制效果，但并不是很明

13、顯;此外心臟和胃腸道切片顯示這些DOX劑型會(huì)產(chǎn)生極強(qiáng)的系統(tǒng)毒性。而NP2/DOX治療組出現(xiàn)了與其他治療組不同的治療效果，隨著治療天數(shù)的延長(zhǎng)，腫瘤體積和重量均明顯減小。在經(jīng)過(guò)NP2/DOX連續(xù)治療7天后，腫瘤的重量?jī)H僅為0.28g，這分別僅為saline，free DOX和NP1/DOX治療7天后腫瘤重量的14.99％，19.60％和19.95％，對(duì)應(yīng)的腫瘤切片也顯示該組腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞損傷區(qū)域面積最大并且程度最為明顯。最為重要的是經(jīng)過(guò)連續(xù)

14、7天的NP2/DOX治療后，小鼠的胃部和腸道切片顯示沒(méi)有明顯的損傷，進(jìn)一步驗(yàn)證了NP2在胃腸道中的超高穩(wěn)定性;同樣地，對(duì)應(yīng)NP2/DOX治療后的心臟切片與對(duì)照組的形貌區(qū)別不大，表明該雙層納米藥物載體不會(huì)產(chǎn)生心臟毒性，具有超高的生物安全性。
　　綜上所述，該雙層結(jié)構(gòu)的納米藥物載體(NP2/DOX)能通過(guò)口服的方式，達(dá)到非常高的生物利用度(75.4％)，連續(xù)給藥后無(wú)系統(tǒng)毒性并且能達(dá)到很好的抗癌效果。因此NP2/DOX在口服給藥領(lǐng)域具有