孢子絲菌雙相轉(zhuǎn)換過(guò)程中形態(tài)學(xué)、蛋白表達(dá)圖譜及DRK1基因表達(dá)水平變化的研究.pdf

1、孢子絲菌病是由申克孢子絲菌引起的皮膚、皮下組織及附近淋巴管的慢性感染。近年,孢子絲菌病的發(fā)生率逐年攀升。孢子絲菌在溫度誘導(dǎo)下可進(jìn)行形態(tài)轉(zhuǎn)換,25℃呈菌絲相生長(zhǎng),37℃則呈酵母相生長(zhǎng)。孢子絲菌向酵母相進(jìn)行形態(tài)轉(zhuǎn)換的過(guò)程與該菌的毒力形成關(guān)系密切。
　　 目的:明確溫度誘導(dǎo)下孢子絲菌向酵母相轉(zhuǎn)化過(guò)程中形態(tài)學(xué)、蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜及DRK1基因表達(dá)水平的變化情況。
　　 方法:1、將活化的孢子絲菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC10268于25℃ SD

2、A液基培養(yǎng)96H后轉(zhuǎn)種于37℃ BHI液基中繼續(xù)振顫培養(yǎng)24H、36H、48H,觀察不同時(shí)段菌體的光鏡及電鏡下形態(tài)。2、雙向電泳分離菌絲相及早期酵母相孢子絲菌的總蛋白質(zhì),以PDQuest8.0軟件進(jìn)行圖像分析,隨機(jī)選取30個(gè)酵母相上調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行肽指紋圖譜分析,Mascot Peptide Mass Fingerprint數(shù)據(jù)檢索確定其功能。3、RACE PCR擴(kuò)增酵母相特異表達(dá)的蛋白質(zhì)組氨酸激酶DRK1的cDNA全長(zhǎng)并進(jìn)行序列測(cè)

3、定,以Bioedit軟件推導(dǎo)氨基酸的序列,并確定其功能區(qū)。
　　 結(jié)果:1、申克孢子絲菌于25℃ SDA和37℃ BHI液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后會(huì)呈現(xiàn)出不同的光鏡及電鏡下形態(tài)特征。2、菌絲相與早期酵母相差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)可達(dá)300個(gè)之多,24個(gè)酵母相上調(diào)或特異表達(dá)的蛋白質(zhì)參與代謝,信號(hào)傳導(dǎo)等諸多過(guò)程。3、孢子絲菌組氨酸激酶DRK1的開(kāi)放閱讀框含3957bp,編碼1319個(gè)氨基酸,含有保守的富含組氨酸H-box、富含天冬氨酸的D-box,

4、ATP結(jié)合區(qū)N-box和催化功能區(qū)G-box。4、與孢子絲菌的菌絲相比較,組氨酸激酶DRK1mRNlA在早期酵母相及酵母相均明顯上調(diào)表達(dá),分別為前者的6.68倍和24.42倍。
　　 結(jié)論:1、菌絲相的孢子絲菌轉(zhuǎn)種于37℃ BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)36H即可出現(xiàn)酵母相的形態(tài)特征。2、孢子絲菌菌絲相與早期酵母相的蛋白表達(dá)圖譜存在明顯的差異,DRK1等蛋白質(zhì)在早期酵母相即上調(diào)表達(dá),可能參與孢子絲菌病的發(fā)生。3,孢子絲菌組氨酸激酶DRK1為