半夏瀉心湯對潰瘍性結(jié)腸炎脾虛型模型大鼠的療效評價及腸道菌群影響.pdf

1、目的：
　　構(gòu)建脾虛型潰瘍性結(jié)腸炎實驗動物模型，并以此模型驗證半夏瀉心湯對潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative Colitis，UC）的療效，同時動態(tài)觀察實驗動物腸道菌群變化，以期探索腸道菌群與UC及半夏瀉心湯療效相關(guān)性。
　　方法：
　　1.脾虛型潰瘍性結(jié)腸炎動物模型的復(fù)制
　　48只SD大鼠隨機分成4組，空白組、模型組、TNBS組（三硝基苯磺酸（TNBS）是一種有機化學(xué)試劑，為半抗原物質(zhì)，單獨灌腸不能引發(fā)結(jié)腸潰

2、瘍，在乙醇灼傷結(jié)腸黏膜后進入黏膜內(nèi)與組織蛋白的賴氨酸ε－氨基團結(jié)合形成完全抗原，進而引起炎癥反應(yīng)及一系列免疫反應(yīng)）、健脾組。模型組單日禁食加4℃水灌胃，雙日充足飲食加豬油灌胃，同時每日上午、下午強迫大鼠游泳，連續(xù)20天，第21天TNBS+50％乙醇灌腸；TNBS組正常飼養(yǎng)20天，第21天TNBS+50%乙醇溶液灌腸；健脾組造模處理同模型組，同時自造模開始每日灌胃四君子湯水煎劑，直至造模結(jié)束；空白組每日灌胃純化水，連續(xù)20天，第21天生理

3、鹽水灌腸。造模期間，每日觀察大鼠精神活動狀態(tài)，體重，食量，大便性狀等一般情況；造模結(jié)束觀察大鼠腹腔及結(jié)腸大體病理改變，并進行結(jié)腸組織切片、HE染色觀察，進行病理評分。
　　2.半夏瀉心湯治療脾虛型潰瘍性結(jié)腸炎的療效觀察與組織病理學(xué)評價
　　72只SD大鼠隨機分為6組，空白組、模型組、陽性組、高劑量組、中劑量組、低劑量組。除空白組外各組按上述方法進行脾虛型潰瘍性結(jié)腸炎模型復(fù)制，模型復(fù)制成功后，陽性組灌胃柳氮磺胺吡啶水溶液，高中

4、低劑量組分別灌胃半夏瀉心湯高中低劑量水煎液，空白組與模型組灌胃等體積純化水，各組灌胃連續(xù)14天。治療期間每日觀察大鼠一般情況，大便性狀，便血情況，進行疾病指數(shù)評價；治療結(jié)束觀察大鼠結(jié)腸大體情況并進行結(jié)腸組織大體損傷指數(shù)，結(jié)腸組織病理切片HE染色觀察及炎癥分級評分。
　　3.16SrDNA測序法動態(tài)檢測半夏瀉心湯對脾虛型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸道菌群影響
　　動物分組，模型復(fù)制及治療同上。分別于造模前、造模中、造模后、治療結(jié)束4個時

5、間點動態(tài)搜集大鼠糞便，提取糞便總DNA進行16S rDNA V4高變區(qū)進行PCR擴增，根據(jù)擴增結(jié)果建立文庫并測序同細菌基因庫比對，進行菌群物種豐度和構(gòu)成分析，觀察各組菌群改變差異情況。
　　結(jié)果：
　　造模中，模型組大鼠出現(xiàn)精神萎靡，嗜睡懶動，扎堆蜷縮弓背，飲食體重明顯下降，活動耐力降低，體毛枯槁雜亂，大便時干時稀等符合大鼠脾虛證的表現(xiàn)；健脾組在相同造模處理下運用四君子湯水煎劑灌胃后沒有出現(xiàn)上述情況，與空白組無差異。TNBS

6、+50%乙醇溶液灌腸后，除空白組外各組均出現(xiàn)體重食量下降，粘液膿血便；結(jié)腸粘膜紅腫，糜爛，潰瘍形成，病理切片HE染色觀察結(jié)腸組織炎細胞浸潤明顯，粘膜缺失，潰瘍形成。
　　半夏瀉心湯組治療中實驗大鼠食量增加明顯與空白組無差異(P≥0.05)，體重在實驗結(jié)束前尚未達到空白組大鼠體重，但較模型組增加顯著(P≥0.05)，大鼠反應(yīng)靈敏，活動度增加，大便性狀恢復(fù)正常，未見粘液膿血便，結(jié)腸大體觀察粘膜顏色紅活，未見潰瘍，病理切片HE染色鏡下觀

7、察炎細胞浸潤不明顯，與模型組比較差異顯著(P<0.05)。與陽性組比較，一般狀態(tài)情況明顯好轉(zhuǎn)，體重食量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。高劑量組各項指標(biāo)略優(yōu)于中低劑量組，顯示出一定的劑量依賴性。
　　大鼠糞便腸道菌群16SrDNA測序發(fā)現(xiàn)腸道菌群結(jié)構(gòu)與UC疾病變化過程高度相關(guān)，隨著造模的進行，菌群結(jié)構(gòu)逐漸改變：擬桿菌、梭菌、變形菌等優(yōu)勢菌群數(shù)量減少；至造模結(jié)束腸道粘膜屏障破壞，菌群結(jié)構(gòu)嚴重失常，并出現(xiàn)“藍細菌”的定植，“藍細菌”是

8、引起環(huán)境污染的菌種，一般不存在于動物體內(nèi)；經(jīng)治療后腸道菌群結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)，“藍細菌”消失，與造模前動物菌群結(jié)構(gòu)相似。半夏瀉心湯組與陽性藥物柳氮磺胺吡啶組菌群結(jié)構(gòu)變化相似，均與疾病變化過程密切相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　實驗選擇造模方法合理，成功復(fù)制出符合潰瘍性結(jié)腸炎病變特征且符合中醫(yī)脾虛證型特點的中醫(yī)病證結(jié)合模型。半夏瀉心湯治療效果肯定，較柳氮磺胺吡啶能顯著幫助恢復(fù)精神和體質(zhì)狀態(tài)，療效更優(yōu)，治療后生活質(zhì)量更佳。16S rDNA測序