氧化還原調控在皮質醇調節(jié)肝細胞內(nèi)質網(wǎng)葡萄糖代謝的機制研究.pdf

1、目的:
　　肝臟是維持體內(nèi)血糖穩(wěn)態(tài)的核心器官，正常時負責循環(huán)中80％葡萄糖的釋放。其中50％源自肝糖原分解，剩下的由肝糖異生。正常情況下，腎臟儲存的少量糖原通過糖異生發(fā)揮作用?？崭箺l件下，糖異生作用增加，其負責循環(huán)中葡萄糖的比例隨著空腹時間的延長和體內(nèi)糖原儲備的下降而升高，空腹24小時約70％，而空腹48小時可達90％以上。因此，糖原分解和糖異生，特別是糖異生是保證空腹時血糖穩(wěn)定和腦、腎等重要器官能量供應的先決條件。而這兩條途徑的

2、最終末反應，即從葡萄糖6磷酸到葡萄糖的過程，是在內(nèi)質網(wǎng)腔內(nèi)由葡萄糖6磷酸酶催化的。
　　機體血糖的穩(wěn)態(tài)離不開神經(jīng)內(nèi)分泌的調節(jié)。作為主要的升糖激素，糖皮質激素(glucocorticoids，GC)在應激、糖尿病、胰島素抵抗、肥胖等代謝性異常中有重要作用。循環(huán)中糖皮質激素主要來源包括:1.腎上腺皮質:受下丘腦-垂體-腎上腺軸調控;2.局部器官:肝臟、脂肪組織等，其中肝臟約占1/3,肝外組織約2/3（主要為脂肪細胞）。其生成主要在內(nèi)質

3、網(wǎng)中，11β-羥基類固醇脫氫酶1（11β-hydroxysteroid dehydrogenase type1,11β-HSD1）催化無活性的皮質酮轉化成有活性的皮質醇。
　　在細胞水平，糖皮質激素通過結合糖皮質激素受體發(fā)揮生理作用，糖皮質激素受體(glucocorticoid receptor，GR)屬于核受體超家族，包括正常的GRα和變異片段GRβ兩類亞型。GR位于細胞漿，與熱休克蛋白(heat shock protein90

4、，HSP90)形成二聚體。糖皮質激素通過擴散作用或其他轉運機制進入細胞漿與受體結合后，受體的原有構象發(fā)生變化，HSP90從受體解離出去，而與糖皮質激素結合的受體則轉移進入細胞核內(nèi)，通過兩種機制引起靶基因轉錄的改變:1.以二聚體形式，通過結合位于受調控基因啟動子內(nèi)的糖皮質激素反應元件(glucocorticoid responseelement，GRE)，進一步改變靶基因轉錄;2.以激素-受體復合物形式，通過調節(jié)其他轉錄因子，進一步影響靶

5、基因的轉錄。然而，有研究發(fā)現(xiàn)GC存在調節(jié)細胞生物活性的非基因調控途徑，并且外周組織生成的皮質醇可局部放大GR激活后的效應。
　　內(nèi)質網(wǎng)腔內(nèi)氧化還原狀態(tài)對其功能有重要影響。正常情況下，高濃度的NADPH/NADP+比率使11β-HSD1具有還原酶活性，以利于活化糖皮質激素。內(nèi)質網(wǎng)腔內(nèi)NADPH生成主要由H6PDH催化G6P代謝生成。由于G6P是G6Pase催化生成葡萄糖的底物，因此內(nèi)質網(wǎng)腔內(nèi)的酶學反應將葡萄糖代謝和糖皮質激素代謝緊緊

6、相連。
　　方法:
　　本研究在既往研究發(fā)現(xiàn)及目前研究現(xiàn)狀基礎上，推測內(nèi)質網(wǎng)腔內(nèi)存在G6P池供H6PD和G6Pase利用，且氧化還原狀態(tài)的改變可導致G6P的重新分配利用，參與葡萄糖代謝。因此，本實驗主要圍繞皮質醇、肝細胞內(nèi)質網(wǎng)氧化還原狀態(tài)及葡萄糖代謝的關系，利用酶反應動力學原理，分別從以下方面進行研究:(1)應用不同G6Pase抑制劑及不同濃度G6P，觀察葡萄糖和二氧化碳的變化，探究內(nèi)質網(wǎng)腔內(nèi)存在G6P池;并通過酶動力學計算

7、，明確H6PDH和G6Pase是否平均分配利用G6P;(2)在不同G6P濃度下，觀察不同濃度皮質醇、皮質酮對葡萄糖和二氧化碳生成的影響;(3)應用皮質醇、皮質酮及11β-HSD1抑制劑，觀察NADPH的變化。由于目前對NADP是否能通過完整內(nèi)質網(wǎng)膜仍有爭議，本研究還觀察不同時間下NADPH的變化。通過上述系統(tǒng)研究，明確皮質醇通過11β-HSD1改變腔內(nèi)NADPH/NADP對葡萄糖合成的刺激作用，為進一步闡明神經(jīng)內(nèi)分泌對糖代謝的調節(jié)提供實

8、驗依據(jù)。
　　結果:
　　1.G6P通過G6PT自細胞漿轉運至內(nèi)質網(wǎng)腔內(nèi)后，形成一個G6P池，作為G6Pase和H6PDH的底物參與相應反應。但通過酶反應動力學方程計算發(fā)現(xiàn)，這兩個酶利用G6P的比例并不均等。
　　2.盡管既往有研究認為完整ER膜對NADP沒有通透性，但本研究通過長時間孵育（30分鐘）發(fā)現(xiàn)NADP可以緩慢透過完整ER膜。
　　3.皮質醇可以通過11β-HSD1改變內(nèi)質網(wǎng)腔內(nèi)的NADPH/NADP+