用于疾病防治的歐洲鰻鱺腸道益生菌的研究.pdf

1、本文從歐洲鰻鱺腸道中篩選出嗜水氣單胞菌的拮抗菌，通過對拮抗菌的理化指標(biāo)測試來進(jìn)一步篩選出三株菌，利用綠色熒光蛋白對其進(jìn)行標(biāo)記，得到能穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的菌株E-Aa3-22，最后研究該標(biāo)記菌在歐洲鰻鱺腸道中的定植作用。
　　 用點(diǎn)種法從歐洲鰻鱺腸道菌群中篩選出65株病原性嗜水氣單胞菌的拮抗菌，進(jìn)一步研究拮抗效果最好的14株拮抗菌的抗菌譜、生長曲線以及與病原性嗜水氣單胞菌的共凝集作用。研究結(jié)果顯示：從NAC瓊脂培養(yǎng)基篩選的2株拮

2、抗菌（Na3-38和Nb3-15）對7株指示菌均有較強(qiáng)的拮抗作用，Aa3-22和Mb3-7對7株指示菌中的5株有拮抗效果；除Na3-38和Nb3-15以外其余12株的生長參數(shù)均大于嗜水氣單胞菌；有11株拮抗菌（Na3-38、Nb3-15、Ab2-55、Ab2-77、Ab1-3、Aa3-22、Aa3-67、Mb1-4、Mb2-10、Mb3-7和Mb3-27）和嗜水氣單胞菌的共凝集率大于10％。這些結(jié)果表明：Aa3-22和Mb3-7在抗菌譜

3、、生長曲線以及與共凝集作用三個方面都適合作為益生菌，Na3-38和Nb3-15除了生長參數(shù)略低于嗜水氣單胞菌外，在抗菌譜和共凝集方面明顯高于其他菌株。
　　 本研究通過構(gòu)建含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）基因的質(zhì)粒，并利用其標(biāo)記歐洲鰻鱺腸道候選益生菌。首先設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增EGFP基因的引物，該引物含有Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)，以質(zhì)粒Pegfp-C1為模板利用Pfu DNA聚合酶PCR擴(kuò)增EGFP的Cdna序列，接著利用Ta

4、q DNA聚合酶在EGFP序列兩3’端加“A”并純化，與Pmd18-T vector連接后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌Top10，正確重組的質(zhì)粒命名為T-EGFP。然后把重組質(zhì)粒和載體質(zhì)粒pET32a進(jìn)行雙酶切，純化連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21，對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和DNA測序，將獲取正確重組的表達(dá)型質(zhì)粒命名為p-EGFP。將表達(dá)型質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至候選益生菌Aa3-22、Mb3-27和Na3-38的感受態(tài)細(xì)胞中，結(jié)果顯示在菌株Aa3-22中能夠穩(wěn)定

5、表達(dá)，編號為E-Aa3-22。
　　 通過綠色熒光蛋白標(biāo)記研究歐洲鰻鱺候選益生菌E-Aa3-22在歐洲鰻鱺腸道的定植作用。E-Aa3-22首先定植于歐鰻腸道的前腸與中腸，在灌胃后3 h時前腸、中腸和內(nèi)容物的E-Aa3-22已達(dá)到104 cfu/g，后腸還未出現(xiàn)E-Aa3-22。E-Aa3-22可以抑制其他細(xì)菌的定植，致使灌胃后6h前腸和中腸的可培養(yǎng)的異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)顯著降低。E-Aa3-22可以定植在歐洲鰻鱺腸道并增殖，在灌胃后的2

6、4-36h，腸壁中的標(biāo)記菌達(dá)到最大值1.0×105 cfu/g左右，至96 h仍大于1.0×103 cfu/g；內(nèi)容物中的E-Aa3-22在36 h達(dá)到最大值，60 h則未能檢出。不同腸段的消化酶活力都表現(xiàn)為前腸＞中腸＞后腸，不同部位酶活性差異極顯著（P<0.01），E-Aa3-22的定植對試驗(yàn)組的前腸段脂肪酶活力和蛋白酶活力有極顯著的抑制作用（P<0.01），對淀粉酶活力以及中后腸段的脂肪酶活力、蛋白酶活力的抑制作用不顯著（P>0.0