維生素D和Ca2+誘導(dǎo)腎結(jié)石形成及其生物學(xué)機(jī)制研究.pdf

1、本文分為以下幾個部分進(jìn)行探討：
　　第一部分 血維生素D與上尿路結(jié)石的相關(guān)性：系統(tǒng)評價與薈萃分析
　　背景和目的：當(dāng)前有眾多研究比較了結(jié)石和非結(jié)石患者血清/血漿1,25(OH)2D3和25(OH)D水平，但是它們的結(jié)果并不一致，甚至相互矛盾。因而我們開展了這項(xiàng)研究以便系統(tǒng)地比較結(jié)石和非結(jié)石患者血維生素D水平的差異。
　　方法：系統(tǒng)檢索PubMed，Web of Science，Cochrane圖書館，中國知網(wǎng)和萬方數(shù)據(jù)

2、庫，篩選納入文獻(xiàn)，并進(jìn)行Meta分析。
　　結(jié)果：最終本研究共納入包含有23228名參與者的32項(xiàng)研究。Meta分析結(jié)果表明，相較于非結(jié)石對照者，結(jié)石患者和含鈣結(jié)石患者血1,25(OH)2D3水平顯著升高（加權(quán)均數(shù)差 WMD,10.19pg/ml;95％CI,4.31-16.07; p=0.0007和 WMD,11.28pg/ml;95%CI,4.07-18.50; p=0.002），但血25(OH)D水平相近（ WMD,0.88

3、ng/ml;95%CI,-1.04-2.80; p=0.37和 WMD,-0.63ng/ml;95%CI,-2.72-1.47;p=0.56）。與對照組和尿鈣正常結(jié)石患者相比，高鈣尿結(jié)石患者血1,25(OH)2D3升高（WMD,9.41pg/ml;95%CI,0.15-18.67;p=0.05 and WMD,2.75pg/ml;95%CI,-0.20-5.69;p=0.07）并伴隨25(OH)D血濃度升高（WMD,5.02ng/ml;

4、95%CI,0.99-9.06;p=0.01和WMD,5.02ng/ml;95%CI,2.14-7.90;p=0.0006）。與非結(jié)石患者相比，尿鈣正常結(jié)石患者血1,25(OH)2D3水平升高（WMD,6.85pg/ml;95%CI,-5.00-18.71;p=0.26）但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且兩者血25(OH)D濃度相近（WMD,0.94ng/ml;95%CI,-3.55-5.43;p=0.68）。進(jìn)一步行敏感性分析得出與上述結(jié)果相似的結(jié)果

5、。結(jié)論：目前的證據(jù)表明血1,25(OH)2D3增加與泌尿結(jié)石相關(guān)，而血25(OH)D升高僅與高鈣尿結(jié)石顯著相關(guān)。尚需進(jìn)一步研究確認(rèn)上述結(jié)果并闡明維生素 D在結(jié)石發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　第二部分 基于維生素D通路激活構(gòu)建高鈣尿結(jié)石大鼠模型
　　背景和目的：目前結(jié)石動物模型以高草酸尿動物模型為主，高鈣尿結(jié)石動物模型較少。經(jīng)典的遺傳性高鈣尿結(jié)石大鼠模型和一些可形成腎間質(zhì)鈣化的基因敲除小鼠存在培育復(fù)雜和價格高昂的局限。相關(guān)研究顯示這

6、些動物模型普遍存在維生素D通路激活的特點(diǎn)，并且我們先前的研究也證實(shí)結(jié)石病人存在血活性維生素D水平增高。因而我們擬通過單純給予 Sprague-Dawley大鼠活性維生素 D，嘗試建立一種相對簡便、經(jīng)濟(jì)、可重復(fù)的高鈣尿結(jié)石動物模型。
　　方法：取6周齡雄性Sprague-Dawley大鼠，隨機(jī)分為維生素D造模組（24只）、對照組（18只）和乙醛酸造模組（6只），正常飲食和飲水。維生素D造模組按100ng/100g體重隔日腹腔注射2n

7、g/ul的1,25(OH)2D3溶液。在第2、4、8和12周時測量體重并測定24小時尿鈣。在第4周、8周和12周隨機(jī)處死8只大鼠，取血測定血鈣、血磷和肝腎功能等指標(biāo)。留取腎臟，行HE和Von Kossa染色觀察顯微結(jié)構(gòu)以及鈣鹽沉積和結(jié)石形成情況，行掃描電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)，行micro CT平掃和三維重建整體觀察腎臟鈣鹽沉積和結(jié)石形成情況。對照組大鼠除隔日腹腔注射對應(yīng)劑量溶劑和定期處死6只大鼠外，其余處理和檢測指標(biāo)與維生素 D造模組相同。乙

8、醛酸造模組大鼠按照10mg/100g體重每日腹腔注射乙醛酸溶液，連續(xù)注射10天。10天后處死取腎臟行HE和Von Kossa染色觀察其顯微結(jié)構(gòu)以及及鈣鹽沉積和結(jié)石形成情況，并與維生素D造模組比較鈣鹽沉積的分布。
　　結(jié)果：維生素D造模組大鼠體重在第4至12周時顯著低于對照組大鼠，肝功能和腎功能指標(biāo)在各周與對照組無明顯差異。維生素 D組大鼠血鈣在各個時間點(diǎn)均顯著高于對照組，而血磷僅在第4周低于對照組。維生素 D組尿鈣濃度以及24小時

9、尿鈣均顯著高于對照組。維生素D造模組大鼠在第4周時，在micro CT上偶見腎實(shí)質(zhì)鈣鹽沉積；在第8周時，石蠟切片Von Kossa染色在腎內(nèi)層髓質(zhì)腎乳頭部位可見明顯鈣鹽沉積，腎盂可見結(jié)石形成，micro CT可見明顯腎實(shí)質(zhì)鈣化和結(jié)石形成；在第12周時，鈣化程度進(jìn)一步加重。行掃描電鏡觀察見腎間質(zhì)鈣化由小的板片狀或同心圓樣礦質(zhì)沉積聚集而成，能譜分析顯示其成分主要包含鈣和磷元素；腎盂結(jié)石則中心結(jié)構(gòu)較為疏松，外層包繞板層狀致密礦質(zhì)結(jié)構(gòu)，其成分亦

10、包含鈣和磷元素。與維生素 D造模組大鼠不同，乙醛酸造模組大鼠腎臟鈣鹽沉積主要位于皮質(zhì)和髓質(zhì)交界處，且鈣鹽沉積主要位于管腔內(nèi)。
　　結(jié)論：按100ng/100g體重隔日腹腔注射1,25(OH)2D3可以誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)高鈣尿、腎間質(zhì)磷酸鹽鈣化和腎盂結(jié)石。本模型可應(yīng)用于腎間質(zhì)鈣化和高鈣尿結(jié)石的研究，且優(yōu)化造模方法可進(jìn)一步優(yōu)化。
　　第三部分 高濃度1,25(OH)2D3和Ca2+誘導(dǎo)腎間質(zhì)鈣化和結(jié)石形成的生物學(xué)機(jī)制研究
　　背

11、景和目的：Randall鈣斑是位于腎間質(zhì)的鈣化，可能是腎結(jié)石形成的起始病變，而1,25(OH)2D3及其誘導(dǎo)的高鈣尿可以促進(jìn)腎間質(zhì)鈣化和腎結(jié)石形成。本研究擬進(jìn)一步證實(shí)Randall鈣斑與結(jié)石的相關(guān)性，并探究高濃度1,25(OH)2D3和Ca2+促進(jìn)腎間質(zhì)鈣化和腎結(jié)石形成的生物學(xué)機(jī)制。
　　方法：基于腹部CT平掃影像學(xué)圖片，比較性別和年齡相匹配的結(jié)石患者和非結(jié)石患者腎乳頭密度（HU值），以進(jìn)一步驗(yàn)證Randall鈣斑理論。基于結(jié)石患

12、者和非結(jié)石患者腎乳頭組織芯片數(shù)據(jù)，靶向分析與抑制異位鈣化相關(guān)基因包括基質(zhì)Gla蛋白（MGP）、骨橋蛋白（OPN）、骨鈣素（OCN）、骨保護(hù)素（OPG）和富Gla蛋白（GRP）在結(jié)石患者和非結(jié)石患者腎乳頭的表達(dá)情況，進(jìn)而確定本研究的核心分子。在動物和/或細(xì)胞水平對上述核心分子基因表達(dá)情況及其功能進(jìn)行驗(yàn)證，并分析高鈣和高維生素D對細(xì)胞增殖、凋亡、氧化應(yīng)激、細(xì)胞損傷修復(fù)以及細(xì)胞與晶體的相互作用等生物學(xué)功能的影響。
　　結(jié)果：最終納入性別

13、和年齡相匹配的結(jié)石和非結(jié)石患者各50例，結(jié)石組患者腎乳頭密度均值顯著高于非結(jié)石患者（49.81±7.12 vs40.98±5.68）。對26例草酸鈣結(jié)石患者和6例非腎結(jié)石對照者的腎乳頭組織基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析顯示，結(jié)石患者腎乳頭MGP表達(dá)下調(diào)3.15倍（p=0.05），OPN、OPG、OCN和GRP表達(dá)分別上調(diào)1.93（p=0.52）、1.16（p=0.58）、1.57（p=0.06）和2.04（p=0.08）倍。免疫組織化學(xué)染色顯示造

14、模組大鼠間質(zhì)鈣化區(qū)域MGP染色強(qiáng)陽性，且鈣化周圍包繞著成纖維細(xì)胞特異蛋白1陽性細(xì)胞。進(jìn)一步免疫組織化學(xué)染色和免疫印跡結(jié)果顯示造模組大鼠腎髓質(zhì)MGP表達(dá)較對照組降低，細(xì)胞免疫熒光和免疫印跡研究發(fā)現(xiàn)高鈣和高維生素D抑制了腎小管上皮細(xì)胞MGP表達(dá)。茜素紅染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高鈣和高維生素 D可誘導(dǎo)大鼠腎成纖維細(xì)胞周圍出現(xiàn)鈣鹽沉積，而外源性補(bǔ)充濃度為0.1ug/ml或0.5ug/ml的MGP后，鈣化則明顯減少甚至消失。造模組大鼠腎組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二

15、醛顯著增高，TUNEL染色顯示腎小管細(xì)胞凋亡增多。CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、劃痕實(shí)驗(yàn)以及晶體粘附實(shí)驗(yàn)證實(shí)，高鈣高維生素D培養(yǎng)基可顯著抑制腎小管上皮細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡，并抑制腎小管上皮細(xì)胞損傷修復(fù)能力，促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞對一水草酸鈣晶體的粘附，但未促進(jìn)其對磷酸鈣晶體的粘附。
　　結(jié)論：腎乳頭鈣化與結(jié)石密切相關(guān)，活性維生素 D聯(lián)合其誘導(dǎo)的高鈣微環(huán)境可能通過下調(diào)MGP的表達(dá)，同時提高腎臟的氧化應(yīng)激水平、促進(jìn)腎小管上