GSP對乙醇損傷后大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)的影響及氧自由基的研究.pdf

1、背景與目的：
　　現(xiàn)如今，人們時?！耙跃茟c功、以酒交友、以酒助興”。酒其主要成分是乙醇，是一種親神經(jīng)的小分子物質(zhì)，能迅速通過血腦屏障，造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)的直接損傷。海馬神經(jīng)元是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中結(jié)構(gòu)和功能最復雜，最特殊的細胞之一，對乙醇毒性作用敏感性較高，長時間的乙醇暴露，可引起海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的改變，從而導致認知能力和記憶能力的降低。本研究主要通過構(gòu)建不同濃度乙醇及葡萄籽原花青素（GSP）作用下的原代大鼠海馬細胞模型，采用激光共聚

2、焦顯微鏡觀察不同時間點的細胞形態(tài)學的改變，酶標儀測定SOD活性、MDA及LDH的含量變化，為進一步探究乙醇對神經(jīng)系統(tǒng)損傷機制和如何減輕乙醇誘導的神經(jīng)細胞損傷提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1、從清潔級（SPF級）的SD大鼠乳鼠（出生24h內(nèi)）分離海馬細胞，培養(yǎng)至第7天，采用SP法進行NSE免疫細胞化學法鑒定細胞純度，選擇生長良好，純度較高的海馬細胞隨機分成低劑量、中劑量、高劑量組，在培養(yǎng)液中加入無水乙醇，使其終濃度為0.5g

3、/L、1.5g/L、3.0g/L。對照組則加入等量的PBS溶液，細胞培養(yǎng)箱中分別作用1h、4h、8h、12h、24h；收集細胞上清液備用，培養(yǎng)液洗3遍后換液后加入低、中、高劑量的葡萄籽原花青素，使其終濃度為1mg/L、2.5mg/L、5mg/L，對照組加入等量的PBS溶液，細胞培養(yǎng)箱中分別作用8h、24h。收集細胞上清液備用。
　　2、采用超氧化物歧化酶測定試劑盒（WST-1法）、微量丙二醛測定試劑盒（TBA法）和乳酸脫氫酶測定試

4、劑盒（微量酶標法）分別測定不同時間點不同濃度乙醇和葡萄籽原花青素作用下的細胞上清液中SOD活力、MDA和LDH含量。
　　3、通過激光共聚焦顯微鏡觀察不同時間點、不同濃度乙醇和葡萄籽原花青素作用下海馬神經(jīng)元形態(tài)的變化。
　　4、統(tǒng)計分析方法：所得數(shù)據(jù)均用據(jù)進行多因素方差分析，LSD法進行兩兩比較，檢驗水平α=0.05。s表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)
　　結(jié)果：
　　1、不同濃度不同時間的乙醇和GSP作用

5、下的海馬細胞上清液中SOD活力、MDA、LDH含量與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P﹤0.05），低劑量乙醇作用后，SOD、MDA、LDH含量變化不明顯，中高劑量乙醇作用后，各時間點SOD活力值明顯下降， MDA和LDH釋放量則明顯升高。作用1h、4h后，SOD活力值不斷減少，MDA和LDH含量不斷升高，高劑量乙醇作用8h后SOD活性僅為10.67±0.393 U/ml，為最低值；與中劑量相比，8h時間點處的高劑量 GSP組的SOD活力

6、升高了1.09±0.987 U/ml。MDA含量浮動最大，降低了0.192±0.002 nmol/mL，與8h、24h高劑量乙醇組相比，低GSP組的SOD活力有所升高，MDA含量略降低，與低劑量組相比，8h高劑量GSP組LDH含量變化最為明顯，與中劑量乙醇組相比，GSP組的 LDH含量差異較為顯著。與高劑量乙醇組相比，高GSP組LDH含量變化最大，降低了189.78±1.68 U/L。
　　2、不同時間不同濃度乙醇作用下的原代海馬

7、神經(jīng)細胞經(jīng)過免疫熒光染色后，對照組細胞胞體形態(tài)多呈梭形、三角形或橢圓形，核居中，胞體飽滿且邊界清晰，發(fā)出一個或多個較粗的絲狀突起，相互連接形成神經(jīng)網(wǎng)絡，染色較為均勻，0.5g/L乙醇作用不同時間的海馬細胞形態(tài)無明顯變化。1.5g/L乙醇作用4h，胞間絲開始減少，作用8h后，受損的細胞開始分泌神經(jīng)元粘附分子（NCAM），促使部分細胞開始聚團，隨著作用時間加長，細胞密度明顯降低，有衛(wèi)星現(xiàn)象出現(xiàn)，胞間絲斷裂，部分消失；3.0g/L乙醇作用1h

8、后，細胞已開始聚團，胞間絲斷裂，變短，隨著作用時間不斷增加，神經(jīng)膠質(zhì)細胞增多，海馬細胞幾乎全部聚團，核變小，藍染加深，細胞呈短棒狀，胞間幾乎不見連接，神經(jīng)網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)已完全破壞，部分細胞已經(jīng)死亡。低中高劑量GSP作用后，可見部分胞體界限變得清晰，胞間絲明顯變粗，染色加深，連接變稠密，部分胞體接近正常，細胞連接恢復，聚團成簇現(xiàn)象明顯減少，可見稀疏的神經(jīng)網(wǎng)絡。
　　結(jié)論：
　　1、乙醇作用海馬細胞后，上清液中SOD活力值明顯降低，

9、MDA和LDH含量明顯升高，且呈現(xiàn)劑量依賴性趨勢，與作用時間相關。說明乙醇增強了海馬細胞氧化應激效應，產(chǎn)生毒性作用。GSP可明顯提高乙醇損傷后海馬細胞上清液中SOD活力值，降低MDA和LDH的釋放與生成，且呈現(xiàn)劑量依賴性趨勢，提示GSP有抗氧化和保護海馬細胞的作用。
　　2、乙醇可使海馬細胞密度降低，胞體損傷，邊界模糊，胞間絲變細變短，甚至斷裂消失，數(shù)量減少，破壞神經(jīng)網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)。GSP對海馬細胞形態(tài)有保護作用，修復受損的海馬細胞，高