青蒿琥酯對宮頸癌U14細胞移植瘤VEGF及COX-2表達的影響.pdf

1、目的:子宮頸癌為最常見的婦科惡性腫瘤之一，近年在發(fā)展中國家發(fā)病年齡有年輕化趨勢。通過手術及放化療的方法雖可改善早期宮頸癌預后，但對導致宮頸癌患者死亡的復發(fā)性、轉移性宮頸癌，其療效尚不理想。手術相對創(chuàng)傷較大而化療藥物長期大量應用可能導致毒性積累，副反應加重甚至化療藥物耐藥，因此尋找高效、無毒的抗腫瘤藥物成為研究熱點。
　　血管生成是促血管形成因子和抑制因子協(xié)調作用的復雜過程，在創(chuàng)傷修復、生長發(fā)育及生殖中占據重要位置。血管內皮細胞生長

2、因子(VEGF)及環(huán)氧合酶2（COX-2）是與腫瘤血管生成密切相關的細胞因子，參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。
　　青蒿琥酯（ART）已證實對于肺癌、中樞神經系統(tǒng)腫瘤、結腸癌、白血病、黑色素瘤、腎臟腫瘤等腫瘤細胞具有良好療效[1]，且副作用小于傳統(tǒng)化療藥物。目前體外研究證實，青蒿琥酯可通過抑制腫瘤組織血管生成，從而抑制腫瘤生長。本實驗通過研究青蒿琥酯作用下宮頸癌 U14移植瘤VEGF及COX-2的表達變化及其與微血管密度（MVD）的相關

3、性，探究青蒿琥酯是否可通過抑制血管生成而發(fā)揮抗腫瘤效應。
　　方法：
　　1.移植瘤動物模型的建立及實驗分組
　　收集對數生長期 U14細胞，調整濃度為1×107/ml，接種于小鼠腹腔（0.7ml/只），待3-5天后腹水形成，取腹水離心后，生理鹽水稀釋為5×107/ml，于雌性KM小鼠（5-6周齡，15-17g）左后肢近背部皮下接種0.2ml。成瘤且腫瘤直徑>5mm進行后續(xù)實驗。將實驗動物隨機分為4組：1、正常對照組（

4、未接種腫瘤，肌注生理鹽水1/日）2、腫瘤對照組（成瘤后，肌注生理鹽水1/日）；3、ART組（成瘤后，肌注青蒿琥酯20mg/kg/d）；4、DDP組（成瘤后，腹腔注射順鉑2mg/kg/d），各給藥0.2ml。每組80只，各組共給藥7日。后各組再次隨機分為4組，分別于第10d、20d、30d、40d處死，每組20只。
　　2.腫瘤組織中VEGF及COX-2表達情況及MVD計數的分析
　　制備腫瘤組織石蠟切片，免疫組化染色后進行圖

5、像分析， VEGF、COX-2表達強度以灰度值（GS）表示，數值大小與陽性細胞表達強度呈反比。以矩形走形計算200個細胞，計算各組陽性細胞表達百分率。
　　光鏡下VEGF染色陽性細胞呈棕黃色，采用weidner等方法進行MVD量化分析。首先在低倍視野下掃視整個組織切片，在腫瘤浸潤區(qū)域選取內皮細胞染色分析、微血管數量密集的視野，隨機選取6個高倍視野，對微血管數計算，計算平均值作為MVD。任何棕黃色陽性內皮細胞或內皮細胞簇，只要與臨近

6、腫瘤細胞、血管及其他結締組織分界清楚，即可作為1個微血管數；腫瘤硬化取和大于8個紅細胞的血管不做計數對象。
　　3.統(tǒng)計學處理：對各組數據通過SPSS13.0版本軟件進行正態(tài)性、方差齊性檢驗，對VEGF、COX-2表達情況及MVD計數進行單因素方差分析（analysis of variance, ANOVA），對于不符合正態(tài)性或方差齊性檢驗者，采取K-independent samples秩和檢驗，SNK法進一步對多樣本均數進行兩

7、兩比較。
　　結果：
　　1.小鼠移植瘤中微血管生成情況
　　與腫瘤對照組移植瘤中MVD計數相比，DDP組及ART組均明顯減低(均P<0.05)。腫瘤組織中MVD計數呈腫瘤對照組>ART組>DDP組的總體趨勢。DDP組及ART組間無明顯統(tǒng)計學差異（P<0.05），除在第20d時 ART組腫瘤組織中 MVD計數較 DDP組明顯增高（21.23±2.71v.s16.69±2.44, P<0.05）。在腫瘤對照組、DDP組及

8、ART組中，各組MVD計數呈10d<20d<30d<40d的總體趨勢，除腫瘤對照組在10d及20d中無顯差異（20.59±2.52v.s22.72±2.97, P>0.05），ART組在20d及30d時無明顯差異（21.23±2.71v.s20.30±5.06, P>0.05），其余各組間均差異顯著（均P<0.05）。
　　2.ART對小鼠移植瘤中VEGF和COX-2表達的影響
　　2.1.對小鼠移植瘤中VEGF表達情況的影

9、響
　　與腫瘤對照組第10天VEGF陽性細胞百分率為（20.58％±3.28%）相比， DDP組明顯降低（14.89%±2.70%, P<0.05），ART組無明顯變化（17.95%±2.02%, P>0.05）。第20d、30d及40d時，移植瘤中VEGF陽性細胞百分率呈腫瘤對照組>ART組>DDP組的總體趨勢，除30d時，ART組與 DDP組之間無明顯差異外（38.54%±7.10%v.s31.67%±3.84%, P>0.0

10、5），其中各組之間均差異顯著（均P<0.05）。ART組、DDP組及腫瘤對照組中VEGF陽性細胞百分率均呈10d<20d<30d<40d的總體趨勢，除 DDP組在第10d和20d時無明顯差異外（14.89%±2.70%v.s17.41%±4.89%, P>0.05），其中各組之間均差異顯著（均P<0.05）。
　　在第10d及40d時，移植瘤中VEGF表達GS值在各組中無明顯統(tǒng)計學差異（ P>0.05）。第20d和30d時，與腫瘤

11、對照組GS值（124.55±1.44,121.67±5.39）相比，ART組明顯降低（118.14±5.33，111.24±6.42, P<0.05）， DDP組在第20d時明顯回升（132.98±3.49，P<0.05），第30d時GS值略有降低(120.40±3.89, P>0.05)。
　　2.2.對小鼠移植瘤中COX-2表達情況
　　與腫瘤對照組第10天時 COX-2陽性細胞百分率(34.10%±6.79%)相比，

12、DDP組明顯減低（16.92%±6.11%， P<0.05）， ART組無明顯變化（30.06%±5.28%，P>0.05）。在第20d、30d及40d時，移植瘤中COX-2陽性細胞百分率呈腫瘤對照組>ART組>DDP組的總體趨勢，除30d時， ART組與DDP組之間無明顯差異外（53.83%±5.54%v.s45.76%±11.83%， P>0.05），其余各組之間均差異顯著（均P<0.05）。ART組、DDP組及腫瘤對照組中COX-

13、2陽性細胞百分率均呈10d<20d<30d<40d的總體趨勢。除ART組在第10d、20d時（30.06%±5.28%v.s31.88%±6.72%, P>0.05），及DDP組在第10d、20d時（16.92%±6.11%v.s19.32%±6.03%, P>0.05）無明顯差異外，各組間均差異顯著（均P<0.05）。
　　與腫瘤對照組第10d時COX-2表達GS值(109.36±5.37)相比， DDP組明顯回升（118.67

14、±3.82, P<0.05），ART組無明顯變化（109.52±6.40, P>0.05）。在第20d、30d及40d時，移植瘤中COX-2陽性細胞表達強度在ART組、DDP組及腫瘤對照組中無明顯統(tǒng)計學差異（均P>0.05）。
　　3.小鼠移植瘤中VEGF、COX-2表達及MVD相關性分析
　　小鼠腫瘤組織中VEGF及COX-2陽性細胞百分率在不同時間均呈正相關（10d:r=0.526, P<0.05;20d:r=0.599

15、, P<0.05;30d:r=0.859, P<0.05;40d:r=0.951, P<0.05）。VEGF陽性細胞百分率與MVD計數之間在不同時間均呈正相關（10d:r=0.773, P<0.05;20d:r=0.558, P<0.05;30d:r=0.804, P<0.05;40d:r=0.565, P<0.05）。COX-2陽性細胞百分率與MVD計數之間在除10d時均呈正相關（10d: r=0.339, P>0.05;20d: r

16、=0.615, P<0.05;30d: r=0.595, P<0.05;40d:r=0.563, P<0.05）。
　　結論：
　　1.青蒿琥酯抑制小鼠 U14移植瘤生長可能與抑制腫瘤組織中 VEGF及COX-2的表達有關。
　　2.青蒿琥酯可顯著阻抑小鼠U14移植瘤中微血管生成，抑制腫瘤組織生長。
　　3.VEGF與 COX-2在腫瘤組織中表達具有正相關關系。COX-2及VEGF與腫瘤組織中微血管生成具有相關性