不同濃度的腫瘤壞死因子-α在急性肝損傷中的雙重作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　急性肝損傷是臨床上較為常見的一種疾病，發(fā)病急、進(jìn)展快、病情重是其特點(diǎn)，因此亟需明確診斷和治療。它是介于惡化和康復(fù)轉(zhuǎn)歸的一種特殊臨界狀態(tài)，如果治療及時(shí)，肝損傷很可能得以控制，并逐漸轉(zhuǎn)愈;反之，則可能惡化，甚至轉(zhuǎn)變?yōu)楦嗡ソ?，?yán)重危害健康。急性肝損傷可由多種疾病發(fā)展而來，如病毒性肝炎、藥物性肝損傷、肝切除、肝移植、內(nèi)毒素性肝損傷、肝缺血再灌注等。這些疾病通常會(huì)引起肝細(xì)胞血流的改變，進(jìn)而造成不同程度的肝細(xì)胞缺氧，從而引起肝組織

2、的損傷。
　　炎癥微環(huán)境對組織損傷的發(fā)生發(fā)展具有重要的作用。而基于對調(diào)控炎癥微環(huán)境治療損傷性疾病越來越受到重視。急性肝損傷的發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，其病情的發(fā)生和發(fā)展和炎癥微環(huán)境的改變密切相關(guān)。早期階段，肝組織內(nèi)的庫普弗細(xì)胞(Kupffer細(xì)胞)和巨噬細(xì)胞被激活后釋放活性氧(reactive oxygen species，ROS)和一些炎癥因子，如白介素類和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF

3、-α)。其中TNF-α在調(diào)節(jié)急性肝損傷過程中發(fā)揮著重要的作用。
　　TNF-α是一種具有多態(tài)性的細(xì)胞因子，能調(diào)節(jié)炎癥、細(xì)胞凋亡、新陳代謝等。TNF-α的這些生物活性和其重要的調(diào)節(jié)功能，與急性肝損傷的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究表明在急性肝損傷的發(fā)生發(fā)展過程中，TNF-α大量生成并啟動(dòng)和調(diào)節(jié)其它炎癥因子的生成;同時(shí)TNF-α快速進(jìn)入損傷的肝細(xì)胞中，誘導(dǎo)啟動(dòng)核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(nuclear factor-κB，NF-κB)的信號(hào)通路

4、的表達(dá)，共同參與肝細(xì)胞的修復(fù)過程。然而，有一些文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)TNF-α在急性肝損傷過程中，加重?fù)p傷的惡化。它通過激活肝細(xì)胞內(nèi)的一系列信號(hào)通路，最終啟動(dòng)凋亡程序加速肝細(xì)胞的死亡。另外有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)臨床上患者血清中TNF-α升高與病情惡化的程度呈正相關(guān)性。
　　盡管目前對TNF-α的研究有著比較深入的了解，但是對于TNF-α在急性肝損傷的具體作用尚不明確?；谏鲜鲅芯勘尘?，我們實(shí)驗(yàn)對此進(jìn)行了深入研究。首先制備了四氯化氮（Carbon tetra

5、chloride，CCl4）皮下注射誘導(dǎo)大鼠急性肝損傷模型;并應(yīng)用不同劑量的TNF-α抑制劑TNFR2融合蛋白變異體(TNFR2-Fc variants，TNFR2-Fcv，是一種基因合成的可溶性蛋白，能與TNF-α結(jié)合并抑制其活性)來觀察不同濃度的TNF-α對急性肝損傷的作用，并探索可能的機(jī)制。
　　方法:
　　(1)急性肝損傷模型的制備:CCl4溶解在玉米油中，配制成40％的濃度。先將TNFR2-Fcv溶液腹腔注射到不同

6、分組的雄性SD大鼠體內(nèi)。15分鐘以后，再將1ml/kg的CCl4皮下注射到相應(yīng)組的大鼠體內(nèi)。24小時(shí)以后，大鼠全部被處死，收集血液和分離新鮮的肝組織，用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
　　(2)實(shí)驗(yàn)分組及處理:將90只體重在200至210g之間的雄性SD大鼠，隨機(jī)分為9組，平均每組10只。這些大鼠分別予以CCl4(-)+0mg/kg TNFR2-Fcv、CCl4(-)+8mg/kg TNFR2-Fcv、CCl4(+)+0mg/kg TNFR2-F

7、cv、CCl4(+)+0.25mg/kgTNFR2-Fcv、CCl4(+)+0.5mg/kg TNFR2-Fcv、CCl4(+)+1mg/kg TNFR2-Fcv、CCl4(+)+2mg/kg TNFR2-Fcv、CCl4(+)+4mg/kg TNFR2-Fcv、CCl4(+)+8mg/kgTNFR2-Fcv處理;同時(shí)我們采用TNF-α-/-大鼠給予1 ml/kg的CCl4皮下注射并將這些處理組的大鼠放置在SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)。輔以25±

8、3℃的室溫下，12小時(shí)晝夜交替光照，并配以標(biāo)準(zhǔn)的飼料和清潔的飲水。
　　(3)血清TNF-α水平的檢測:用ELISA檢測分析不同劑量的TNFR2-Fcv作用于急性肝損傷大鼠后，血清中TNF-α的濃度，以明確體內(nèi)不同濃度的TNF-α對急性肝損傷的作用。
　　(4)肝損傷的檢測:從血液中析出血清，在自動(dòng)分析儀中檢測各組血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate t

9、ransaminase，AST)的水平。將肝組織石蠟包埋后制成組織切片，HE染色分析各組肝組織切片的脂肪變性程度;免疫組化技術(shù)和Tunnel試劑盒檢測組織切片中Cleaved-caspase3的表達(dá)和肝細(xì)胞凋亡的水平，判斷各組肝損傷的程度。
　　(5)炎癥因子水平的檢測:實(shí)時(shí)定量PCR(Real time-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測急性肝損傷過程中，體內(nèi)不同濃度TNF-α對炎癥因子如IL

10、-4、IL-6、IL-8、IL-1β和IFN-γ等的表達(dá)影響。
　　(6) NF-κB信號(hào)通路及抗凋亡基因的檢測:Western-Blotting檢測不同濃度的TNF-α在急性肝損傷過程中NF-κB信號(hào)通路的表達(dá)包括IκBα(inhibitor of NF-kappaB-α)、p-IκBα(Phospho-IκBα)和NF-κB-p65的表達(dá)。以及RT-PCR和Western-Blotting檢測相關(guān)抗凋亡基因的表達(dá)如BCL-2(

11、B-cell leukemia lymphoma2)、BCL-XL(B-celllymphoma-extra large)、XIAP(X-linked Inhibitor of Apoptosis Protein)，和FHC(Ferritinheavy chain)。
　　(7)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:數(shù)據(jù)結(jié)果采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組之間的均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤采用方差分析（Analysis of Variance，ANOVA）進(jìn)行

12、檢驗(yàn)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩組之間的差別采用Student-T檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果:
　　(1)在CCl4誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷模型中，血清TNF-α的濃度隨著TNF-α抑制劑TNFR2-Fcv劑量的增加而逐漸下降，呈明顯的相關(guān)性。
　　(2)在CCl4誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷模型中，血清ALT和AST明顯上升，即ALT:從36.75±8.73U/L上升至193.27±14.26 U/

13、L; AST:從150.86±12.34 U/L上升至253.79±12.90U/L，p＜0.01。HE染色發(fā)現(xiàn)肝組織中有大量的脂肪變性，同時(shí)免疫組化染色Cleaved-caspase3陽性的細(xì)胞數(shù)量明顯增多、Tunnel凋亡試劑染色發(fā)現(xiàn)凋亡的肝細(xì)胞數(shù)目增多和Western-Blotting檢測凋亡抗體表達(dá)增強(qiáng)。
　　(3)在正常大鼠中，無論TNF-α抑制劑TNFR2-Fcv劑量如何改變，血清ALT和AST水平基本不變，基本處于正

14、常范圍之內(nèi)。而在CCl4誘導(dǎo)大鼠的急性肝損傷模型中，隨著TNFR2-Fcv的劑量從0mg/kg逐漸遞加到8mg/kg時(shí)，體內(nèi)TNF-α水平逐漸下降，血清ALT和AST水平的變化呈明顯的“V”字型改變，即TNFR2-Fcv從0mg/kg增加至1mg/kg時(shí)，血清ALT和AST的值逐漸下降(P＜0.01); HE染色發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞脂肪變性的程度減輕;免疫組化和Tunnel檢測到凋亡的肝細(xì)胞數(shù)目明顯減少(P＜0.05)。然而，隨著TNFR2-Fc

15、v的劑量進(jìn)一步加大，從1mg/kg增加至8mg/kg時(shí)，TNF-α的濃度繼續(xù)降低（至8mg/kg時(shí)，TNF-α接近于0pg/ml），血清ALT和AST的值反而逐漸上升，甚至在8mg/kg時(shí)，ALT和AST水平較0mg/kg時(shí)要高(P＜0.05); HE染色發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞脂肪變性的程度反而加重;免疫組化和Tunnel檢測到凋亡的肝細(xì)胞數(shù)目也大幅度增多(P＜0.05)。
　　(4)在TNF-α-/-的大鼠中，CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷時(shí)，血清

16、ALT和AST水平較野生型正常大鼠的明顯升高(P＜0.01); HE染色觀察到單視野肝脂肪變性十分嚴(yán)重。
　　(5) RT-PCR的結(jié)果提示在急性肝損傷過程中，隨著TNFR2-Fcv劑量的增加，TNF-α濃度逐漸下降，促炎因子IL-6、IL-8、IL-1β和IFN-γ水平逐漸下降，而抑炎因子IL-4的水平反而逐漸上升。
　　(6) Western-Blotting和RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在急性肝損傷過程中隨著TNF-α濃度

17、逐漸下降，NF-κB信號(hào)通路基因p-IκBα和NF-κB-p65的表達(dá)以及抗凋亡基因包括Bcl-XL、FHC、XIAP和Bcl-2的表達(dá)也逐漸下降。
　　結(jié)論:
　　(1) TNF-α在調(diào)節(jié)急性肝損傷過程中發(fā)揮著重要的作用，適當(dāng)?shù)亟档腕w內(nèi)TNF-α濃度可有效地緩解肝損傷，然而，過度地降低TNF-α濃度反而會(huì)加重肝損傷。
　　(2) TNF-α的損害和保護(hù)的雙重作用始終貫穿在急性肝損傷的發(fā)生和發(fā)展過程。其濃度與主要發(fā)揮的