腫瘤壞死因子受體Ⅱ在視網(wǎng)膜新生血管發(fā)生發(fā)展及細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制研究.pdf

1、腫瘤壞死因子受體II(Tumor necrosis factor2,TNFR2)是腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)受體蛋白大家族的主要成員，參與許多生理及病理性過程，在細(xì)胞生長、激活、生存和遷移等方面都起到了重要作用。目前，關(guān)于它的研究主要集中于淋巴細(xì)胞。新生血管發(fā)生是許多疾病的主要病理特征和嚴(yán)重并發(fā)癥，包括眼部血管性疾病和腫瘤等。然而，目前關(guān)于TNFR2在血管內(nèi)皮細(xì)胞以及血管發(fā)生發(fā)展中的生理和病理作用

2、研究很少。因此，本研究以視網(wǎng)膜血管為切入點(diǎn)，以氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型為主要方法，觀察了TNFR2在視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的發(fā)育、新生血管發(fā)生以及高氧誘發(fā)的血管退縮/生長停滯中的作用；同時(shí)，通過體外研究探索了TNFR2在內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、存活和凋亡中的作用及其作用機(jī)制。
　　 第一部分常氧下TNFR2對視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)發(fā)育的影響
　　 目的：探索TNFR2是否參與常氧下枧網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的發(fā)育。
　　 方法：采用TNFR2基因敲

3、除小鼠(TNFR2-KO)、野生型小鼠(C57BL/6J，B6)和血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性高表達(dá)TNFR2(VETNFR2)轉(zhuǎn)基因小鼠，于其出生后不同時(shí)間摘取眼球制作視網(wǎng)膜鋪片和石蠟切片，并行血管染色，比較不同時(shí)期各種基因型小鼠視網(wǎng)膜血管的生長速度及形態(tài)特征。
　　 結(jié)果：TNFR2-KO、B6和VETNFR2小鼠在視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)發(fā)育上無顯著差異。生后(Postnatal)第三天(P3)，血管從視乳頭長出，位于視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層，分布于

4、視乳頭至視網(wǎng)膜邊緣的1/3～1/4范圍。生后第5天(P5)，視網(wǎng)膜血管延伸至視乳頭至視網(wǎng)膜邊緣的1/2范圍。生后第7天(P7)，視網(wǎng)膜血管幾乎到達(dá)視網(wǎng)膜邊緣。生后第7天開始，淺層血管逐漸向視網(wǎng)膜深層發(fā)展，依次生成位于外叢狀層的次級血管網(wǎng)和位于內(nèi)叢狀層外側(cè)緣的三級血管網(wǎng)，表層血管網(wǎng)逐漸由最初的多邊形網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成喬木樣結(jié)構(gòu)。P7，P9和P11時(shí)，三種小鼠的視網(wǎng)膜深層血管發(fā)育速度也相似。
　　 結(jié)論：TNFR2對小鼠視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)

5、發(fā)育無顯著影響。
　　 第二部分TNFR2在氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型中的作用研究
　　 目的：探討TNFR2對氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型中細(xì)胞凋亡和新生血管形成的影響。
　　 方法：采用TNFR2-KO、B6和VETNFR2乳鼠，建立氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型。實(shí)驗(yàn)組(Hyperoxia，H)于生后第7天將乳鼠隨同母鼠置于含氧體積分?jǐn)?shù)為75％的飼養(yǎng)箱中5天，然后回到正常大氣環(huán)境中繼續(xù)飼養(yǎng)5天；對照組一直置于常氧環(huán)境中飼養(yǎng)(Nor

6、moxia，N)。于P12(出氧箱)時(shí)行視網(wǎng)膜鋪片和冰凍切片TUNEL染色比較視網(wǎng)膜中央無血管區(qū)大小及細(xì)胞凋亡情況。于P17(新生血管形成最多)時(shí)制作視網(wǎng)膜鋪片和眼球石蠟切片，比較深層血管的恢復(fù)和視網(wǎng)膜前病理性新生血管的發(fā)生情況；行石蠟切片PCNA和p-P65染色檢測視網(wǎng)膜細(xì)胞的增殖以及NF-kB通路的激活；此外，檢測并比較視網(wǎng)膜中炎癥及血管發(fā)生相關(guān)因子包括VEGFR2、TNF-α、HIF-1α、Bmx、VEGF-A、AngII、ERK

7、和STAT3的mRNA和/或蛋白水平。
　　 結(jié)果：常氧環(huán)境中飼養(yǎng)的各組小鼠視網(wǎng)膜血管形態(tài)均正常。高氧組所有小鼠造模成功，但不同基因型小鼠問存在差異。P12時(shí)，與B6小鼠相比，TNFR2-KO小鼠視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞數(shù)增多，無灌注區(qū)增大；而VETNFR2小鼠其視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞數(shù)減少，無灌注區(qū)減小。P17時(shí)，TNFR2-KO小鼠的無灌注區(qū)最大，B6小鼠和VETNFR2小鼠之間沒有顯著差異；TNFR2-KO小鼠的視網(wǎng)膜深層血管網(wǎng)絡(luò)的恢復(fù)明顯

8、遲于B6和VETNFR2小鼠；視網(wǎng)膜鋪片及石蠟切片結(jié)果顯示B6小鼠的視網(wǎng)膜前新生血管形成較TNFR2-KO小鼠多，但較VETNFR2小鼠少，此結(jié)果與PCNA染色結(jié)果相一致；同時(shí)，出氧箱后相對缺氧誘發(fā)p-P65表達(dá)增高，此反應(yīng)在TNFR2-KO小鼠中減弱并在VETNFR2小鼠中增強(qiáng)。通過RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，相對缺氧誘導(dǎo)VGFR2、TNF-α、HIF-1α、Bmx、VEGF-A和AngII的mRNA水平表達(dá)增高，并且TNF-α、Bmx和

9、AngII的增高在三種基因型小鼠中存在差異。此外，我們通過western雜交方法發(fā)現(xiàn)相對缺氧激發(fā)VGFR2、HIF-1α、ERK和STAT3的表達(dá)增高或活化，并且此反應(yīng)在TNFR2-KO小鼠中減弱，而在VETNFR2小鼠中增強(qiáng)。
　　 結(jié)論：TNFR2表達(dá)在氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型中抑制細(xì)胞凋亡，減少無血管區(qū)的形成；促進(jìn)血管生長因子和炎癥因子的釋放和活化，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和新生血管形成。
　　 第三部TNFR2對血管內(nèi)皮細(xì)胞

10、生長和遷移作用的體外研究
　　 目的：探索TNFR2在肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長和遷移中的作用。
　　 方法：分離、培養(yǎng)TNFR2-KO和B6小鼠來源的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Murine LungMicrovascular Endothelial Cell，MLEC)，并進(jìn)行永生化處理。使用WST-1比色法和劃痕損傷試驗(yàn)檢測并比較兩種細(xì)胞的增殖能力和遷移能力。
　　 結(jié)果：成功分離、培養(yǎng)并永生化小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，用免

11、疫組織化學(xué)方法鑒定細(xì)胞純度。B6小鼠來源的內(nèi)皮細(xì)胞較TNFR2-KO來源的內(nèi)皮細(xì)胞增殖更快，遷移能力更強(qiáng)。缺氧刺激可促進(jìn)兩種細(xì)胞的增殖和遷移能力；TNF刺激增強(qiáng)B6來源細(xì)胞的增殖和遷移能力，對TNFR2-KO細(xì)胞無明顯影響。
　　 結(jié)論：TNFR2在體外促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長和遷移。
　　 第四部分TNFR2在細(xì)胞存活和凋亡中的作用及機(jī)制研究
　　 目的：通過比較TNFR2野生型(TNFR2-WT)和突變型(T

12、NFR2-59)，探索其在細(xì)胞(特別是內(nèi)皮細(xì)胞)存活和凋亡中的作用及發(fā)生機(jī)制。
　　 方法：使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或者電穿孔轉(zhuǎn)染的方法使目的基因高表達(dá)，通過AnnexinV/PI染色和細(xì)胞計(jì)數(shù)判定細(xì)胞凋亡的程度，Western雜交和報(bào)告基因方法檢測TNF信號通路下游各種分子的激活及細(xì)胞凋亡信號通路的激活，通過免疫熒光的方法檢測目的蛋白的表達(dá)部位及其共定位，此外使用免疫沉淀的方法檢測兩種蛋白的結(jié)合狀態(tài)。
　　 結(jié)果：TNFR2-W

13、T在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，對細(xì)胞的性狀無影響；TNFR2-59(TNFR2的羧基端59個(gè)堿基缺失)只表達(dá)于胞質(zhì)內(nèi)，可引起細(xì)胞核呈病態(tài)濃縮。Anneixn V/PI染色結(jié)果顯示在293T細(xì)胞中TNFR2-59過表達(dá)可引起細(xì)胞凋亡，并在TNF刺激下進(jìn)一步加重；而TNFR2-WT在TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起保護(hù)作用。Western雜交結(jié)果顯示TNFR2-59激發(fā)線粒體依賴性和非依賴性細(xì)胞凋亡通路，而TNFR2-WT抑制Caspase家族介導(dǎo)

14、的細(xì)胞凋亡通路。究其原因，TNFR2-WT和TNFR2-59介導(dǎo)不同的信號分子激活。報(bào)告基因和western雜交結(jié)果均證實(shí)TNFR2過表達(dá)可介導(dǎo)JNK和NF-kB通路的激活，而TNFR2-59只能激活JNK、不能激活與細(xì)胞存活相關(guān)的NF-kB。隨后，我們發(fā)現(xiàn)TNFR2-WT和TNFR2-59在內(nèi)皮細(xì)胞存活/凋亡中的作用和在293T細(xì)胞中相似。并且，兩者在細(xì)胞凋亡和TNF信號通路中的作用均依賴于TNFR1。免疫熒光染色顯示在內(nèi)皮細(xì)胞中TN

15、FR1和TNFR2-WT或TNFR2-59均有共定位。免疫沉淀進(jìn)一步證實(shí)TNFR2-WT和TNFR2-59相互結(jié)合發(fā)揮作用，而TNFR2的胞內(nèi)近膜段是其與TNFR1結(jié)合的關(guān)鍵部位。此外，TNFR2-59參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的TNFR1復(fù)合物II形成，而TNFR2-WT則激活促細(xì)胞存活的NF-kB途徑，這很可能是TNFR2-WT和TNFR2-59在細(xì)胞存活/凋亡中發(fā)揮不同作用的原因。
　　 結(jié)論：表達(dá)于細(xì)胞膜上的TNFR2通過激活NF