腫瘤壞死因子1型受體在小鼠后肢缺血模型中的雙重作用.pdf

1、外周動(dòng)脈病是一種進(jìn)展性的疾病,其發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)而升高,60歲以上男性約為16﹪,女性則為13﹪.約25﹪患者最終需血運(yùn)重建治療,5﹪患者發(fā)展為重度下肢缺血.而這些重度下肢缺血患者目前治療手段有限,部分患者最終因?yàn)閲?yán)重缺血導(dǎo)致截肢,而截肢后預(yù)后并不佳.外周動(dòng)脈閉塞常發(fā)生于動(dòng)脈粥樣硬化基礎(chǔ)之上,治療不及時(shí)將導(dǎo)致肢體壞死甚至喪失生命.栓塞和血栓形成是外周動(dòng)脈急性閉塞的兩個(gè)主要原因,目前主要的治療方法是外科手術(shù)和溶栓治療.外科手術(shù)雖然是經(jīng)典的

2、治療金標(biāo)準(zhǔn),但由于相關(guān)并發(fā)癥其30天死亡率高達(dá)15﹪～20﹪,因而仍有待改進(jìn).近年來的前瞻性隨即對(duì)照臨床研究表明溶栓治療作為初始療法可降低隨后外科手術(shù)風(fēng)險(xiǎn),提高肢體存活率,但是出血并發(fā)癥并不少見,顱內(nèi)出血發(fā)生率為1～2﹪.此外部分慢性重度下肢缺血并不適合外科手術(shù)和溶栓治療,而急性外周動(dòng)脈閉塞用外科手術(shù)和溶栓治療開通動(dòng)脈的同時(shí)也應(yīng)設(shè)法減少肢體死亡,因此有必要探索新的治療方法. 人體中腫瘤壞死因子(tumor necrosis fa

3、ctor,TNF)合成后以26kDa的前體多肽結(jié)合于細(xì)胞膜上,在TNF轉(zhuǎn)換酶催化下裂解為17kDa可溶性TNF單體,最終形成有活性的同型三聚體.TNF升高在充血性心力衰竭、急性心肌梗死和腦缺血中起著不良作用.TNF主要通過腫瘤壞死因子l型受體(tumor necrosis factorreceptor 1,TNFR-1,又名P55)和TNFR-2(又名P75)兩個(gè)受體起作用,與TNFR-1結(jié)合后可通過激活caspase促進(jìn)細(xì)胞凋亡,也可

4、通過NFκB而促進(jìn)細(xì)胞生存.大多數(shù)急性心肌梗死或心肌病的動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)TNF的不良作用可能由TNFR-1介導(dǎo).Tuo~sto等的研究表明急性下肢缺血患者骨骼肌TNF信號(hào)通路表達(dá)上調(diào),升高倍數(shù)分別為TNF(3.7倍)、TNF轉(zhuǎn)換酶(15.3倍)、TNFR-1(2.9倍).但是這種上調(diào)和組織缺血壞死間有沒有直接的因果關(guān)系還不明確,目前未見相關(guān)報(bào)道. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?本研究以腫瘤壞死因子1型受體敲除小鼠(TNFR-1<'-/->)和野生型小鼠

5、(WT)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,觀察TNFR-1在小鼠急性后肢缺血中對(duì)組織壞死的作用,以及在隨后恢復(fù)期中對(duì)血管新生的效應(yīng). 實(shí)驗(yàn)方法: C57BL/6 WT和C57BL/6 TNFR-1<'-/->小鼠經(jīng)4﹪水合氯醛腹腔注射麻醉,結(jié)扎左側(cè)股動(dòng)靜脈近端、遠(yuǎn)端及其主要分支,右側(cè)股動(dòng)脈為假手術(shù)處理,僅分離股動(dòng)靜脈而不結(jié)扎.為標(biāo)記新生的血管內(nèi)皮細(xì)胞,術(shù)后3天起動(dòng)物每天1次腹腔注射BrdU(50 mg/kg體重)直至處死.術(shù)后1周對(duì)后肢缺血損

6、傷進(jìn)行半定量評(píng)估(0分:沒有改變;1分:輕度膚色改變;2分:中到重度膚色改變;3分:壞死;4分:自發(fā)截肢).術(shù)后1、3、7、14和21天動(dòng)物用4﹪水合氯醛麻醉后用激光多普勒灌注成像系統(tǒng)測(cè)量雙側(cè)后肢血流灌注值,然后兩組各處死7只動(dòng)物,取等量?jī)?nèi)收肌提取蛋白,取腓腸肌置于O.C.Z復(fù)合物中后制成厚8岬的冰凍切片,標(biāo)本立即保存于-80℃冰箱中.術(shù)后2天兩組同法處死3只動(dòng)物,取等量?jī)?nèi)收肌提取DNA,電泳檢測(cè)細(xì)胞凋亡DNA片段.使用TUNEL染色觀

7、察缺血后1天腓腸肌組織細(xì)胞凋亡情況,Hoechst 33342染細(xì)胞核以計(jì)數(shù)總細(xì)胞.術(shù)后1天內(nèi)收肌蛋白標(biāo)本W(wǎng)estern blot測(cè)定Caspase-3、Bax蛋白的表達(dá).術(shù)后21天腓腸肌標(biāo)本免疫組化染色CD31和BrdU,CD31標(biāo)記的為血管內(nèi)皮細(xì)胞,CD31和BrdU共標(biāo)記的為新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞.為探討TNFR-1敲除對(duì)缺血后血管新生的影響機(jī)制,非缺血對(duì)照小鼠及缺血后1、3、7、14、21天兩組小鼠內(nèi)收肌蛋白標(biāo)本經(jīng)Western b

8、lot測(cè)定血管形成素受體Tie-2、血管形成素-1(angiopoietin-1,Ang-1)、血管形成素-2(angiopoietin-2,Ang-2)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,,VEGF)表達(dá)改變. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 術(shù)后1、3、7天.TNFR-1<'-/->組缺血后肢血流灌注值顯著高于WT組,術(shù)后1天腓腸肌切片TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著低于WT組.TNFR-

9、1<'-/->組缺血評(píng)分也顯著低于WT組,相應(yīng)地兩組的自發(fā)截肢率分別為0﹪、50﹪.TNFR-1<'-/->組DNA凋亡梯帶、Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)減弱,表明敲除TNFR-1可以減少細(xì)胞凋亡.然而從術(shù)后14天起,兩組間的缺血后肢血流灌注值差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義.術(shù)后21天CD31免疫熒光染色提示兩組間血管內(nèi)皮細(xì)胞總數(shù)相似,但CD31和BrdU共標(biāo)記的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)TNFR-1<'-/->組顯著低于WT組,提示TNFR-1<

10、'-/->小鼠缺血后血管新生活動(dòng)受損.與WT小鼠相比,Western blot提示TNFR-1<'-/->小鼠Ang-1及其受體Tie-2表達(dá)下調(diào). 實(shí)驗(yàn)結(jié)論: 1.TNFR-1敲除可抑制TNF信號(hào)通路下游死亡相關(guān)蛋白的激活,減少細(xì)胞死亡和凋亡,顯著降低缺血后自發(fā)截肢的發(fā)生率,對(duì)急性后肢缺血有保護(hù)作用.2.TNFR-1是后肢缺血后的血管新生活動(dòng)重要參與者,缺乏TNFR-1抑制了缺血后血管新生活動(dòng),其下游介導(dǎo)機(jī)制為Ang