siRNA沉默EC109細胞中腫瘤壞死因子受體1對細胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、目的:
　　腫瘤壞死因子受體1(tumor necrosis factor receptor1,TNFR1)是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)的膜受體之一。TNFR1在人體內廣泛分布于正常細胞膜表面,也存在于多種腫瘤細胞表面。TNFR1與配體TNF-α或TNF-β結合后,啟動相關的信號通路,功能涉及到細胞的活化、增殖、凋亡及細胞毒活性等方面,但在不同的細胞,可以出現相反的結果,其作用機制目前尚不完

2、全清楚。RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)引發(fā)的普遍存在于生物體中的序列特異性基因轉錄后沉默過程,越來越廣泛地應用于基礎實驗研究。本研究主要應用RNAi的實驗方法,沉默食管癌細胞系EC109中TNFR1的表達,隨后探討對照組與實驗組細胞增殖、凋亡等生物學行為的變化。
　　材料和方法:
　　1. EC109細胞用DM

3、EM+F12培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)傳代,RNAiso Reagent提取細胞總RNA, RT-PCR檢測細胞中TNFR1在基因水平的表達。EC109細胞用DMEM+F12培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)傳代,胰酶消化后收集貼壁生長的細胞,PBS清洗、離心、裂解,試劑盒分級提取可溶性亞細胞蛋白組分,所得膜蛋白進行Western Blot分析,檢測EC109中TNFR1在蛋白水平的表達。
　　2. EC109細胞用DMEM+F12培養(yǎng)基在六孔板內培養(yǎng),在對轉染

4、條件進行優(yōu)化后,對細胞進行轉染,細胞分三組:空白對照組(未加轉染試劑及 siRNA),陰性對照組(加入轉染試劑及陰性對照siRNA),實驗組(加入轉染試劑及TNFR1-siRNA)。RNAiso Reagent消化細胞后提取各組細胞總RNA,RT-PCR檢驗基因水平轉染效果。試劑盒分級提取可溶性亞細胞蛋白組分,Western Blot技術檢驗蛋白水平轉染效果。
　　3.轉染24小時后倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)。
　　4.將E

5、C109細胞種于96孔板,對轉染條件進行優(yōu)化,細胞轉染后用四甲基偶氮唑藍(MTT)檢測轉染前后細胞增殖能力的改變,繪制細胞生長曲線。
　　5.收集轉染后六孔板中各組細胞,應用流式細胞術檢測細胞凋亡的變化情況。
　　結果:
　　1.由RT-PCR以及Western Blot等手段驗證TNFR1在食管癌細胞系EC109中高表達。
　　2.將TNFR1-siRNA轉染進EC109細胞中,成功封閉了TNFR1的表達。

6、r>　　3. RNAi處理后,三組細胞在形態(tài)上沒有顯示差別;RNAi處理后MTT檢測結果顯示,空白對照組和陰性對照組的細胞32小時內的細胞增殖沒有差異(P>0.05),實驗組的細胞增殖加快(P<0.05);RNAi處理后空白對照組和陰性對照組的細胞凋亡情況無差異(P>0.05),實驗組的細胞凋亡率降低(P<0.05)。
　　結論:
　　1. TNFR1在食管癌細胞系EC109中高表達。
　　2.阻斷TNFR1的表達使食