初步優(yōu)選三棱莪術抑制HaCaT細胞增殖最佳成分劑量組合及其機理研究.pdf

1、目的：初步優(yōu)選出三棱莪術藥對中抑制HaCaT細胞（即人永生化上皮細胞）增殖的有效成分劑量組合，并對其抑制機理進行研究，為進一步研究該藥對治療銀屑病提供科學理論依據。
　　方法：（1）采用MTT法檢測IFN-γ(干擾素-γ)不同濃度(0、5、10、20、50、100ng/mL）對HaCaT細胞增殖的影響，并選出IFN-γ促HaCaT細胞增殖的最佳濃度；
　?。?）采用MTT法檢測三棱中琥珀酸、蘆丁、香草醛、亞油酸、芒柄花素、山

2、柰素、香草酸、棕櫚酸等以及莪術中莪術油、異龍腦、吉馬酮、姜黃素、龍腦、莪術二酮、β-胡蘿卜素、莪術醇等有效成分不同濃度(0，5，10，20，50，100mol·L-1)和不同時間（24h、48h、72h）對HaCaT細胞增殖的影響，各藥物組均用最佳促HaCaT細胞增殖的濃度的IFN-γ對HaCaT細胞促增殖，并設置同樣濃度IFN-γ組以及空白組。
　?。?）采用正交實驗和MTT法優(yōu)選出一組抑制HaCaT細胞增殖的三棱和莪術有效成分

3、的最佳劑量組合，同時設置空白組和IFN-γ組，并對正交實驗結果進行驗證。
　?。?）采用ELISA法檢測三棱莪術最佳組合、各有效單體成分（香草酸、琥珀酸、異龍腦和姜黃素）、IFN-γ以及空白組作用過的HaCaT細胞分泌IL-2和TLR-2的含量。
　　（5）采用Western blot法觀察三棱莪術最佳組合、各有效單體成分（香草酸、琥珀酸、異龍腦和姜黃素）、IFN-γ以及空白組對HaCaT細胞hedghog信號通道蛋白PTC

4、H1的表達的影響。
　　結果：（1）干擾素-γ能促進HaCaT細胞增殖且呈濃度依賴性趨勢，與空白組相比，濃度為5ng/mL的IFN-γ對HaCaT細胞就有一定的促增殖作用（P<0.05），濃度為50ng/mL的IFN-γ對HaCaT細胞的促增殖作用最明顯基本達到最大效應（P<0.01）。
　?。?）三棱中蘆丁、芒柄花素、香草醛、亞油酸、山柰素、棕櫚酸等有效成分以及莪術中吉馬酮、龍腦、莪術二酮、β-胡蘿卜素、莪術醇等有效成分在

5、24h、48h、72h的不同濃度均無明顯抑制HaCaT細胞增殖的作用；而莪術油24h的全部濃度以及異龍腦、姜黃素、琥珀酸、香草酸等有效成分在24h的濃度為10mol·L-1、20mol·L-1、50mol·L-1、100mol·L-1對HaCaT細胞增殖均有抑制作用,其中莪術油24h的20mol·L-1和50mol·L-1濃度以及異龍腦24h濃度為20mol·L-1對HaCaT細胞抑制作用最強。因此，選出的三棱有效成分為香草酸和琥珀酸，

6、莪術有效成分為異龍腦和姜黃素，劑量都選3個，即10、20、50，時間24h，按L9（34）進行正交實驗。
　　(3)正交實驗的主次關系為：琥珀酸>姜黃素>異龍腦>香草酸，最佳劑量組合為：50mol·L-1香草酸、50mol·L-1琥珀酸、20mol·L-1異龍腦和50mol·L-1姜黃素。
　?。?）ELISA實驗結果：與空白組相比，IFN-γ組的IL-2含量有明顯差異（P<0.01）；INF-γ組的TLR-2含量有差異（P

7、<0.05）；各藥物組的IL-2含量均有顯著差異（P<0.001），均有明顯減少，各藥物組的TLR-2含量均有明顯差異（P<0.01），均有不同程度減少。其中以三棱莪術有效成分最佳劑量組合組的IL-2和TLR-2含量最少，IFN-γ組的IL-2和TLR-2含量最多。
　?。?）蛋白印跡試驗表明各藥物組作用于HaCaT細胞后均能下調hedghog信號通道的蛋白PTCH1的表達，其中以三棱莪術有效成分最佳劑量組合組下調蛋白PTCH1表

8、達的作用最強，IFN-γ組下調蛋白PTCH1的表達作用最弱。
　　結論：（1）三棱中香草酸和琥珀酸以及莪術中異龍腦和姜黃素對HaCaT細胞增殖均有抑制作用，三棱莪術有效成分組合組對HaCaT細胞增殖有明顯的抑制作用；
　　（2）IFN-γ可增強HaCaT細胞分泌IL-2、TLR-2；
　　（3）各藥物組可使活化的HaCaT細胞IL-2和TLR-2的分泌明顯降低并以三棱莪術有效成分組合組降低最多，說明IL-2和TLR2的