初步優(yōu)選三棱莪術(shù)抑制HaCaT細(xì)胞增殖最佳成分劑量組合及其機(jī)理研究.pdf

1、目的：初步優(yōu)選出三棱莪術(shù)藥對(duì)中抑制HaCaT細(xì)胞（即人永生化上皮細(xì)胞）增殖的有效成分劑量組合，并對(duì)其抑制機(jī)理進(jìn)行研究，為進(jìn)一步研究該藥對(duì)治療銀屑病提供科學(xué)理論依據(jù)。
　　方法：（1）采用MTT法檢測(cè)IFN-γ(干擾素-γ)不同濃度(0、5、10、20、50、100ng/mL）對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響，并選出IFN-γ促HaCaT細(xì)胞增殖的最佳濃度；
　　（2）采用MTT法檢測(cè)三棱中琥珀酸、蘆丁、香草醛、亞油酸、芒柄花素、山

2、柰素、香草酸、棕櫚酸等以及莪術(shù)中莪術(shù)油、異龍腦、吉馬酮、姜黃素、龍腦、莪術(shù)二酮、β-胡蘿卜素、莪術(shù)醇等有效成分不同濃度(0，5，10，20，50，100mol·L-1)和不同時(shí)間（24h、48h、72h）對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響，各藥物組均用最佳促HaCaT細(xì)胞增殖的濃度的IFN-γ對(duì)HaCaT細(xì)胞促增殖，并設(shè)置同樣濃度IFN-γ組以及空白組。
　?。?）采用正交實(shí)驗(yàn)和MTT法優(yōu)選出一組抑制HaCaT細(xì)胞增殖的三棱和莪術(shù)有效成分

3、的最佳劑量組合，同時(shí)設(shè)置空白組和IFN-γ組，并對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。
　?。?）采用ELISA法檢測(cè)三棱莪術(shù)最佳組合、各有效單體成分（香草酸、琥珀酸、異龍腦和姜黃素）、IFN-γ以及空白組作用過的HaCaT細(xì)胞分泌IL-2和TLR-2的含量。
　?。?）采用Western blot法觀察三棱莪術(shù)最佳組合、各有效單體成分（香草酸、琥珀酸、異龍腦和姜黃素）、IFN-γ以及空白組對(duì)HaCaT細(xì)胞hedghog信號(hào)通道蛋白PTC

4、H1的表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：（1）干擾素-γ能促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖且呈濃度依賴性趨勢(shì)，與空白組相比，濃度為5ng/mL的IFN-γ對(duì)HaCaT細(xì)胞就有一定的促增殖作用（P<0.05），濃度為50ng/mL的IFN-γ對(duì)HaCaT細(xì)胞的促增殖作用最明顯基本達(dá)到最大效應(yīng)（P<0.01）。
　?。?）三棱中蘆丁、芒柄花素、香草醛、亞油酸、山柰素、棕櫚酸等有效成分以及莪術(shù)中吉馬酮、龍腦、莪術(shù)二酮、β-胡蘿卜素、莪術(shù)醇等有效成分在

5、24h、48h、72h的不同濃度均無明顯抑制HaCaT細(xì)胞增殖的作用；而莪術(shù)油24h的全部濃度以及異龍腦、姜黃素、琥珀酸、香草酸等有效成分在24h的濃度為10mol·L-1、20mol·L-1、50mol·L-1、100mol·L-1對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖均有抑制作用,其中莪術(shù)油24h的20mol·L-1和50mol·L-1濃度以及異龍腦24h濃度為20mol·L-1對(duì)HaCaT細(xì)胞抑制作用最強(qiáng)。因此，選出的三棱有效成分為香草酸和琥珀酸，

6、莪術(shù)有效成分為異龍腦和姜黃素，劑量都選3個(gè)，即10、20、50，時(shí)間24h，按L9（34）進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。
　　(3)正交實(shí)驗(yàn)的主次關(guān)系為：琥珀酸>姜黃素>異龍腦>香草酸，最佳劑量組合為：50mol·L-1香草酸、50mol·L-1琥珀酸、20mol·L-1異龍腦和50mol·L-1姜黃素。
　?。?）ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與空白組相比，IFN-γ組的IL-2含量有明顯差異（P<0.01）；INF-γ組的TLR-2含量有差異（P

7、<0.05）；各藥物組的IL-2含量均有顯著差異（P<0.001），均有明顯減少，各藥物組的TLR-2含量均有明顯差異（P<0.01），均有不同程度減少。其中以三棱莪術(shù)有效成分最佳劑量組合組的IL-2和TLR-2含量最少，IFN-γ組的IL-2和TLR-2含量最多。
　　（5）蛋白印跡試驗(yàn)表明各藥物組作用于HaCaT細(xì)胞后均能下調(diào)hedghog信號(hào)通道的蛋白PTCH1的表達(dá)，其中以三棱莪術(shù)有效成分最佳劑量組合組下調(diào)蛋白PTCH1表

8、達(dá)的作用最強(qiáng)，IFN-γ組下調(diào)蛋白PTCH1的表達(dá)作用最弱。
　　結(jié)論：（1）三棱中香草酸和琥珀酸以及莪術(shù)中異龍腦和姜黃素對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖均有抑制作用，三棱莪術(shù)有效成分組合組對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用；
　?。?）IFN-γ可增強(qiáng)HaCaT細(xì)胞分泌IL-2、TLR-2；
　　（3）各藥物組可使活化的HaCaT細(xì)胞IL-2和TLR-2的分泌明顯降低并以三棱莪術(shù)有效成分組合組降低最多，說明IL-2和TLR2的