嗜鉻粒蛋白A在擴張型心肌病中的表達及其與心肌纖維化的關(guān)系和機制研究.pdf

1、嗜鉻粒蛋白A(CGA)廣泛分布于神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng),因其半衰期長而成為評估整個神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)活性的強有力指標。在擴張型心肌病中,交感神經(jīng)興奮性的長期低水平增強對于疾病進程具有激活作用;促進心肌細胞死亡、凋亡和刺激心肌間質(zhì)膠原的增生重構(gòu),使心肌間質(zhì)膠原增加、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原比例失調(diào),從而使心肌細胞失去了堅韌的膠原支持而變形,左心室在功能上從壓力泵轉(zhuǎn)換為容量泵,心室球形化,最終導(dǎo)致心衰?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在心血管系統(tǒng)中,CGA具有交感神經(jīng)抵抗作用,并與

2、慢性心衰癥狀的嚴重程度和預(yù)后密切相關(guān);分子水平上CGA參與了對纖維母細胞的黏附和伸展作用,提示其與心肌重塑有關(guān)。然而CGA與心肌纖維化的作用目前未見報道。因此本實驗擬觀察CGA在擴張型心肌病表達的量與部位的變化,探討CGA與心肌纖維化的關(guān)系,以進一步研究神經(jīng)內(nèi)分泌因素在DCM中的作用,從而為臨床心肌纖維化的評估提供新的指標和思路。
　　 已知在人體中,CGA作為一個前體肽,在不同的組織中被分解為不同的分泌片段發(fā)揮其相應(yīng)的作用。C

3、atestatin(Human CGA352-372),是CGA家族中的一員,也是目前為止已知的CGA家族中唯一直接作用于煙堿受體而發(fā)揮作用的。同時作為強有力的內(nèi)源性煙酸膽堿受體拮抗劑,抑制兒茶酚胺的釋放,并具有負性肌力作用。那么抑制兒茶酚胺的釋放和功能,是否對心肌細胞凋亡、成纖維細胞增殖和遷移有一定影響?目前為止尚未見有文獻資料。本研究擬通過catestatin抑制兒茶酚胺的作用,觀察心肌纖維化的發(fā)生,并進一步探討catestatin

4、影響心肌纖維化的可能機制。
　　 第一部分嗜鉻粒蛋白A在擴張型心肌病中的表達
　　 目的：觀察擴張型心肌病(DCM)患者外周血及心肌組織中嗜鉻粒蛋白A(CGA)的表達。
　　 方法：收集DCM患者及正常健康志愿者外周血血清,用ELISA方法檢測樣本血清中CGA水平。取DCM心臟移植患者的廢棄心肌組織樣本,以及排除心臟疾病的腦外傷尸檢心肌組織標本。利用RT-PCR技術(shù)檢測心肌中嗜鉻粒蛋白(CGA)的mRNA在DCM

5、心肌和正常心肌中的表達變化;應(yīng)用免疫組化鑒定心肌中CGA的分布位置及其表達強弱變化。
　　 結(jié)果：ELISA顯示DCM病人外周血中CGA為187.6±94.7ng/ml;正常健康志愿者外周血中CGA為130.6±21.1ng/ml(P＜0.05)。和正常對照心肌相比,RT-PCR證實DCM心肌組織中CGA-mRNA表達升高(P＜0.001)。免疫組化表明在DCM心肌中CGA顆粒粗大、部位密集,與正常心肌樣本比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜

6、0.05)。
　　 結(jié)論:作為神經(jīng)內(nèi)分泌活性強有力指標的CGA在DCM心肌及外周血循環(huán)中表達均升高。
　　 第二部分擴張型心肌病中嗜鉻粒蛋白A的表達與心肌纖維化的關(guān)系
　　 目的：觀察嗜鉻粒蛋白A(CGA)在擴張型心肌病(DCM)中的表達、心肌纖維化程度及其二者間的關(guān)系,初步探討CGA在心肌纖維化進程中的作用。
　　 方法：取DCM心臟移植患者的心肌組織標本作為研究對象,排除心臟疾病的腦外傷尸檢心肌組織標

7、本作為對照。利用Real-time PCR方法檢測心肌中嗜鉻粒蛋白A(CGA)及Ⅰ型膠原纖維(COLⅠ),Ⅲ型膠原纖維(COLⅢ)、基質(zhì)金屬蛋白酶(ADAMTS-1)的mRNA表達,并分析其相關(guān)性。免疫組化技術(shù)鑒定心肌中CGA的分布位置及其表達強弱變化;運用苦味酸天狼猩紅特異染色和偏振光顯微鏡顯像,并輔以圖象分析軟件計算心肌膠原容積積分(CVF);并對CGA與心肌纖維化的相關(guān)性進行形態(tài)學(xué)上的比較。
　　 結(jié)果：免疫組化表明,CG

8、A在DCM心肌中表達增加(P＜0.05)。CVF證實DCM心肌中膠原容積積分較正常心肌增加(P＜0.001)。Real-time PCR證實心肌中CGA-mRNA與COLⅠ-mRNA、COLⅢ-mRNA、ADAMTS-1-mRNA三者均具有相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)分別為0.729、0.95、0.665;形態(tài)學(xué)上,嗜鉻粒蛋白A呈現(xiàn)陽性的部位及其分布密集區(qū)域的附近,心肌纖維化明顯。
　　 結(jié)論：DCM心肌中CGA的表達與心肌纖維化具有密切的

9、相關(guān)性。由此可以推測DCM心肌組織中CGA的表達水平影響著心肌纖維化的發(fā)展。
　　 第三部分 catestatin抑制心肌纖維化的機制探討
　　 目的：擬通過CGA活性片段catestatin抑制兒茶酚胺的作用,觀察心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展,并進一步探討catestatin影響心肌纖維化的可能機制。
　　 方法：按照人eatestatin序列(Human CGA352-372)合成此氨基酸序列,以HPLC分析其純度

10、。取1-3d的SD大鼠,在無菌條件下從心肌中利用差速貼壁法分離出心肌細胞和成纖維細胞。分別設(shè)立異丙腎上腺素(ISO)濃度組:10umol/L、20umol/L、40umol/L以及catestatin濃度組1umol/L、2umol/L、4umol/L、10umol/L、25umol/L。應(yīng)用流式細胞技術(shù)(FACS)檢測各組心肌細胞的凋亡率,以觀察ISO對心肌細胞的損傷作用、以及catestatin是否對ISO刺激所造成的心肌損傷有修復(fù)

11、治療作用。利用細胞計數(shù)法(CCK-8)檢測不同濃度的catestatin對成纖維細胞增殖的抑制作用;采用細胞劃痕損傷實驗檢測不同濃度catestatin對成纖維細胞遷移的影響。
　　 結(jié)果：經(jīng)HPLC質(zhì)譜分析證實,合成的catestatin純度為99.21％。FACS檢測顯示:ISO梯度濃度損傷組中,在單純使用不同濃度ISO刺激心肌細胞后,結(jié)果表明:隨著ISO濃度升高、心肌細胞凋亡比率增加(P＜0.001);catestatin

12、治療組中,預(yù)先使用ISO20umol/L損傷細胞、后采用不同濃度的catestatin治療,結(jié)果顯示:5個不同濃度的catestatin均能降低ISO(20umol/L)誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡(P＜0.05),且該作用呈現(xiàn)濃度依賴性(P＜0.05)—即catestatin濃度越高,對ISO所造成的心肌細胞損傷的修復(fù)作用越明顯,心肌細胞凋亡率越低。CCK-8檢測發(fā)現(xiàn):與正常對照組相比,低濃度的catestatin(1umol/L)作用于成纖維

13、細胞24h后,即可導(dǎo)致成纖維細胞增值率下降,差別具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001);在catestatin濃度達到4umol/L以后,其抑制作用即可呈現(xiàn)平臺期。劃痕實驗結(jié)果顯示:與正常對照組相比,經(jīng)過catestatin作用后,成纖維細胞向劃痕內(nèi)遷移的距離較對照組有所縮小;在catestatin濃度達到4umol/L以后,開始出現(xiàn)抑制成纖維細胞遷移的作用(P＜0.001),隨著catestatin劑量的增大,抑制作用越明顯。