多功能天然高分子納米藥物輸送體系的構(gòu)建及抗腫瘤研究.pdf

1、近年來，隨著材料科學(xué)和納米技術(shù)的發(fā)展，納米藥物輸送體系的研究不斷深入，目前已成為腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。與傳統(tǒng)小分子化療藥物相比，納米藥物載體能顯著提高負(fù)載藥物的腫瘤傳輸效率并降低藥物的副作用。納米藥物載體之所以能夠向腫瘤和正常組織差異性的輸送治療藥物，是基于其對(duì)腫瘤組織的高滲透性和滯留效應(yīng)(EPR effect)。由于腫瘤周圍血管異常和淋巴回流缺失，納米藥物載體可穿透腫瘤組織并在特定部位釋放藥物，從而減少對(duì)正常組織的損傷，減少副作用。然而

2、，納米藥物載體在腫瘤中的傳輸過程主要包括血管傳輸，跨血管傳輸和腫瘤間質(zhì)傳輸三個(gè)主要步驟，而由于腫瘤生理的異常，如致密的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)、淋巴系統(tǒng)的缺失引起升高的間隙壓力等，每一個(gè)傳輸過程都是納米藥物載體向腫瘤實(shí)質(zhì)滲透時(shí)需要克服的屏障。通過EPR效應(yīng)被動(dòng)富集在腫瘤的納米載體，雖然可以從血管中滲出，但不能有效的穿過ECM，只能在血管周圍不均勻堆積，無法有效的被癌細(xì)胞攝取，大大降低了抗腫瘤效果。另外由于EPR效應(yīng)受腫瘤位置，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)量

3、，孔徑大小等因素的影響，被動(dòng)靶向僅限于某些類型的腫瘤，而且EPR效應(yīng)僅限于一些直徑大于約4.6mm的實(shí)體瘤。為了克服這些缺點(diǎn)，本論文通過在納米載體表面共價(jià)修飾腫瘤靶向配體（苯硼酸、乳糖酸）及可以降解ECM的蛋白酶（菠蘿蛋白酶），構(gòu)成多功能納米載體，有望克服單功能納米藥物載體在腫瘤中的滲透障礙，增強(qiáng)藥物的腫瘤富集、滲透和細(xì)胞攝取，從而提高抗腫瘤效果。此外，由于天然高分子材料不僅來源廣泛，價(jià)格便宜，易修飾，能夠大批量的分離和提純，以及良好的

4、生物相容性和生物可降解性，安全無毒等優(yōu)點(diǎn)。因此，本論文選擇以天然高分子為基材設(shè)計(jì)制備了一系列納米藥物傳遞系統(tǒng)?？傊菊撐脑O(shè)計(jì)的多功能納米粒子具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、結(jié)構(gòu)與功能精確可控以及生物可降解等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)納米載體在抗腫瘤治療領(lǐng)域的應(yīng)用和新型納米載藥體系的發(fā)展意義重大。研究?jī)?nèi)容主要分如下三個(gè)部分:
　　(1)以生物相容性良好的明膠(Type B)為起始材料，通過去溶劑法成功制備了明膠納米粒子(NPl)。將腫瘤靶向配體3-羧基苯硼酸(3-C

5、PBA)通過共價(jià)作用修飾在NP1表面構(gòu)建了具有腫瘤靶向功能的納米粒子(NP2)。通過透射電鏡(TEM)、掃描電鏡(SEM)和動(dòng)態(tài)光散射(DLS)研究了NP1和NP2的形貌結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性。結(jié)果表明，NP1和NP2均呈球形結(jié)構(gòu)，并在各種條件下具有較好的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性。選擇阿霉素(DOX)作為抗腫瘤藥物模型并將其負(fù)載到NP1和NP2分別得到載藥納米粒子NPl-DOX和NP2-DOX，在不同pH值下考察了載藥納米粒子的藥物釋放行為，發(fā)現(xiàn)隨著pH從7

6、.4下降到5.0，納米粒子的阿霉素釋放速率顯著增加。分別利用平面細(xì)胞模型（SH-SY5Y細(xì)胞、H22細(xì)胞和HepG2細(xì)胞）和三維(3D)培養(yǎng)的多細(xì)胞球體(SH-SY5YMCS)通過激光共聚焦顯微鏡(CLSM)、流式細(xì)胞儀(FCM)和MTT法等系統(tǒng)研究了NPl-DOX和NP2-DOX的體外細(xì)胞攝取及細(xì)胞毒性。最后，通過H22荷瘤小鼠模型利用近紅外活體成像儀、腫瘤組織病理學(xué)分析、抗腫瘤實(shí)驗(yàn)等方法研究了兩種載藥納米粒子的腫瘤富集、滲透及抑制能

7、力。所有結(jié)果表明，通過3-CPBA的修飾，可以顯著提高納米粒子的腫瘤識(shí)別能力，從而提高其在腫瘤部位的富集和抗腫瘤效果。
　　(2)以水溶性和生物相容性優(yōu)良的羧甲基殼聚糖(CMCS)為起始材料，通過去溶劑法制備了羧甲基殼聚糖納米粒子(CM NPs)。選擇3-羧基苯硼酸（3-CPBA）作為腫瘤靶向配體，將其修飾到CM NPs表面得到具有腫瘤靶向功能的納米粒子(CB NPs)。利用動(dòng)態(tài)光散射(DLS)、透射電鏡(TEM)和掃描電鏡(SE

8、M)對(duì)兩種納米粒子的粒徑大小、形貌結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性進(jìn)行表征。結(jié)果表明，CM NPs和CB NPs均顯示接近球形結(jié)構(gòu)，大小均一，且在各種條件下具有較好的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性。阿霉素(DOX)作為模型藥物成功包載于納米粒子得到載藥納米粒子CM-DOX和CB-DOX NPs。通過單層細(xì)胞模型和三維多細(xì)胞球體(MCS)研究了這些載藥納米粒子的生物學(xué)效應(yīng)。結(jié)果表明3-CPBA的修飾可以提高納米粒子的腫瘤富集和滲透能力。利用H22腫瘤肺轉(zhuǎn)移小鼠模型評(píng)價(jià)了這些載

9、藥納米粒子的體內(nèi)抗腫瘤效果。結(jié)果表明，與CM-DOX NPs相比，CB-DOXNPs具有較好的腫瘤富集和滯留能力，從而顯著減小了H22腫瘤肺轉(zhuǎn)移小鼠的腫瘤大小。所有結(jié)果證明，CB NPs作為一種新型納米藥物載體，在腫瘤靶向給藥方面具有很大的潛力。
　　(3)腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)是阻礙藥物在腫瘤組織中擴(kuò)散的主要障礙。針對(duì)此問題，選擇良好生物相容性的殼聚糖作為起始材料，首先利用乳糖酸與腫瘤細(xì)胞表面過表達(dá)受體（脫唾液酸糖蛋白）的特異

10、性識(shí)別作用，將腫瘤靶向配體乳糖酸修飾到殼聚糖表面得到腫瘤靶向的聚合物(CLA)，通過去溶劑法成功制備了CLANPs。隨后通過共價(jià)作用將菠蘿蛋白酶修飾在CLA NPs表面得到CLABNPs，提高其穿透ECM到達(dá)腫瘤細(xì)胞的能力。利用動(dòng)態(tài)光散射(DLS)、透射電子顯微鏡(TEM)和掃描電子顯微鏡(SEM)測(cè)定和觀察了這些納米粒子的粒徑大小、形貌結(jié)構(gòu)以及在不同條件下的穩(wěn)定性。將阿霉素(DOX)作為模型藥物成功包載于CLA和CLAB NPs，并在

11、三種不同pH（7.4，6.5和5.5）下考察了其藥物釋放曲線。酶活性實(shí)驗(yàn)證明，修飾到納米粒子表面的菠蘿蛋白酶仍保持其酶活性。利用HepG2和SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞攝取和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，與游離DOX相比，乳糖酸修飾的腫瘤靶向納米粒子顯示出對(duì)肝癌細(xì)胞的高選擇性以誘導(dǎo)有效的細(xì)胞毒性作用。體外三維(3-D)培養(yǎng)的多細(xì)胞球體（SH-SY5Y和HepG2MCS）實(shí)驗(yàn)表明CLAB-DOX NPs顯著提高了DOX在MCS中的滲透。體內(nèi)藥物