沉默因子NRSF對(duì)環(huán)境重金屬鉛作用下SV2C的調(diào)控.pdf

1、研究目的：
　　鉛是一種自然界廣泛存在的有毒重金屬，鉛暴露可造成機(jī)體多個(gè)系統(tǒng)的損傷，尤其是對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。鉛的神經(jīng)毒性一直備受關(guān)注，但其毒性機(jī)制至今仍未完全闡明。大量的研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元限制性沉默因子（Neuron-restrictive silencer factor, NRSF）在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中具有十分重要的作用，它是一種含鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，能特異性的與神經(jīng)元限制性沉默元件（Neuron-restrictive sile

2、ncer element, NRSE）結(jié)合，來(lái)抑制含NRSE基序的神經(jīng)特異性基因的轉(zhuǎn)錄，這些基因?qū)π纬刹⒕S持神經(jīng)元的表型、神經(jīng)元突觸可塑性有十分重要的作用。突觸囊泡蛋白2C（Synaptic vesicle glycoprotein2C, SV2C）在神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和突觸的傳遞中起著重要的作用，我們前期研究發(fā)現(xiàn)鉛暴露可導(dǎo)致小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(Neuro-2a, N2a)中SV2C的mRNA和蛋白質(zhì)水平明顯下調(diào)，但鉛是如何改變SV2C基

3、因的轉(zhuǎn)錄水平仍不清楚。通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)SV2C啟動(dòng)子區(qū)含有NRSE基序。故本研究建立鉛暴露大鼠模型，探討鉛暴露對(duì)大鼠海馬NRSF和SV2C表達(dá)的影響。以及建立體外培養(yǎng)的N2a細(xì)胞鉛暴露模型，探討鉛暴露對(duì)N2a細(xì)胞NRSF和SV2C表達(dá)的影響。最后，在鉛暴露的N2a細(xì)胞模型基礎(chǔ)上干擾NRSF的表達(dá)，觀察鉛暴露是否通過(guò)影響NRSF的表達(dá)來(lái)調(diào)控SV2C的轉(zhuǎn)錄水平。本研究為鉛暴露引起的神經(jīng)毒性機(jī)制提供線索，并為尋找新的治療鉛中毒藥物提供理

4、論依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1、鉛暴露對(duì)斷乳SD大鼠海馬NRSF和SV2C表達(dá)的影響：性成熟雌性SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（雙蒸水）、低（0.5 g/L）、高（2.0 g/L）劑量醋酸鉛暴露組，采取自由飲水方式進(jìn)行醋酸鉛暴露，連續(xù)暴露10 d后，按雌：雄為2:1合籠交配，將受孕成功的雌性大鼠繼續(xù)飲水方式暴露醋酸鉛，直至仔鼠斷乳（出生后3周）。雄性仔鼠在斷乳時(shí)，采用Morris水迷宮系統(tǒng)檢測(cè)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力；采用電感耦合等

5、離子體發(fā)射光譜儀（ICP-AES）檢測(cè)大鼠全血和海馬組織中鉛含量；采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（ Reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR）檢測(cè)大鼠海馬NRSF和SV2C mRNA表達(dá)情況；進(jìn)行蛋白免疫印跡法（Western blot, WB）檢測(cè)大鼠海馬NRSF和SV2C蛋白表達(dá)情況；采用免疫熒光法（Immunofluorescent, IF）檢測(cè)NRSF蛋白在大鼠海馬

6、組織各區(qū)域的表達(dá)情況。
　　2、鉛暴露對(duì)N2a細(xì)胞NRSF和SV2C表達(dá)的影響：在N2a細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)穩(wěn)定后，加入濃度梯度為0μM（空白對(duì)照組）、1μM和100μM的醋酸鉛進(jìn)行染鉛處理培養(yǎng)48 h后，使用RT-PCR法檢測(cè)N2a細(xì)胞NRSF和SV2C mRNA的表達(dá)情況；采用IF法檢測(cè)NRSF蛋白的表達(dá)情況。
　　3、NRSF對(duì)SV2C mRNA的影響：100μM的醋酸鉛處理兩組N2a細(xì)胞，沉默組轉(zhuǎn)染NRSF-siRNA，對(duì)照

7、組轉(zhuǎn)染DDW，轉(zhuǎn)染后兩組同時(shí)鉛暴露處理48 h，使用RT-PCR和Western blot法分別檢測(cè)NRSF mRNA及蛋白水平的表達(dá)變化，采用RT-PCR法檢測(cè)SV2C mRNA的表達(dá)變化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1、鉛暴露會(huì)引起大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力下降：Morris水迷宮獲得性訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，各組大鼠在訓(xùn)練第4d的平臺(tái)逃避潛伏期總體上存在顯著差異。第4d各組大鼠潛伏期時(shí)間隨著鉛暴露劑量增加呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性延長(zhǎng)（P<0.05）。

8、Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比較，低、高劑量鉛暴露組穿越平臺(tái)次數(shù)更少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且低、高劑量鉛暴露組間比較也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　2、鉛暴露會(huì)引起大鼠的血鉛和海馬組織鉛水平增加：ICP-AES檢測(cè)表明，大鼠血鉛濃度和海馬鉛含量均隨著鉛暴露濃度增加而增加，且呈現(xiàn)一定的劑量反應(yīng)關(guān)系（P<0.05）。
　　3、鉛暴露影響大鼠海馬NRSF的表達(dá)：RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，大鼠海

9、馬NRSF mRNA表達(dá)水平隨著鉛暴露濃度增加呈現(xiàn)劑量反應(yīng)性增加（P<0.05）。WB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)， NRSF蛋白表達(dá)水平也隨著鉛暴露濃度增加呈現(xiàn)劑量反應(yīng)性增加（P<0.05）。IF檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，海馬CA1、CA3以及DG區(qū)NRSF蛋白表達(dá)水平隨著鉛暴露濃度的增加呈劑量反應(yīng)性增加（P<0.05）。
　　4、鉛暴露影響大鼠海馬SV2C的表達(dá)：RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，大鼠海馬SV2C mRNA表達(dá)水平隨著鉛暴露濃度增加呈現(xiàn)劑量反應(yīng)性下降（P<0

10、.05）。WB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)， SV2C蛋白表達(dá)水平也隨著鉛暴露濃度增加呈現(xiàn)劑量反應(yīng)性下降（P<0.05）。
　　5、鉛暴露影響N2a細(xì)胞中NRSF的表達(dá)：RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，N2a細(xì)胞NRSF mRNA表達(dá)水平隨著鉛暴露濃度增加呈現(xiàn)劑量反應(yīng)性增加（P<0.05）。IF檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著鉛暴露濃度的增加，N2a細(xì)胞NRSF蛋白表達(dá)水平增強(qiáng)，且呈劑量反應(yīng)關(guān)系（P<0.05）。
　　6、鉛暴露影響N2a細(xì)胞中SV2C mRNA的表達(dá)：R

11、T-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，N2a細(xì)胞SV2C mRNA表達(dá)水平隨著鉛暴露濃度增加呈現(xiàn)劑量反應(yīng)性下降（P<0.05）。
　　7、在100μM的醋酸鉛作用下，與對(duì)照組相比，NRSF沉默組N2a細(xì)胞NRSF mRNA及蛋白的表達(dá)水平均顯著下調(diào)（P<0.05），而SV2C mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　鉛暴露通過(guò)上調(diào)NRSF的表達(dá)來(lái)抑制其下游靶基因SV2C的轉(zhuǎn)錄水平，導(dǎo)致下調(diào)了SV2C mRNA的表達(dá)，