巴斯德桿菌科細菌復制溫敏型質粒的構建及初步應用.pdf

1、巴斯德桿菌科(Pasteurellaceae)主要包括巴氏桿菌屬(Pasteurella),放線桿菌屬(Actinobacillus)和嗜血桿菌屬(Haemophilus)。此菌科包含大量使動物致病的病原體,它們可以使很多家畜致病甚至死亡,給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失,全世界對此菌科的病原菌的關注度日益增高。
　　 為了研究致病菌的致病機理,對其基因的功能進行研究是必須的。基因功能研究的常規(guī)方法是構建基因突變菌株。目前使用的基因

2、突變方法,如自然轉化,接合轉移以及自殺質粒電轉化的轉化效率和發(fā)生同源重組雙交換的效率比較低下,所以一套高效的突變系統(tǒng)的建立是非常必要的。由于復制溫敏型質粒在特定溫度下能夠自動丟失,能夠快速鑒定發(fā)生同源重組雙交換的突變體,并且在PCR定向突變系統(tǒng)中能夠充當表達載體和介導雙交換的克隆載體,在重組酶的輔助下,雙交換的概率會大大提高,因此復制溫敏型質粒能夠很大程度上提高突變系統(tǒng)的效率。
　　 本研究對巴斯德桿菌科細菌來源的質粒pD70K

3、anR進行了序列測定和分析,發(fā)現(xiàn)此質粒具有一個卡那霉素抗性基因,一個鏈霉素抗性基因和一個磺胺抗性基因,還含有一個在結合轉移中必不可少的mobA基因,并用DNAMAN軟件分析了此質粒的酶切位點,得到了一些單一酶切位點,可用于克隆。隨后,驗證了pD70KanR在APP和Pm中都是穿梭質粒,通過PCR定點突變,構建了在Pm和APP中的復制溫敏型質粒pGA318和pSK-GA318,并分析了這兩個質粒在Pm和APP中不同傳代時間和培養(yǎng)溫度下的復

4、制特性,即在30℃可以正常復制,經(jīng)過傳代,在高于41℃的情況下丟失。pGA318和pSK-GA318在Pm中,42℃?zhèn)?代即可丟失；pGA318和pSK-GA318在APP中,42℃要傳9代才能丟失。這些結果為構建Pm和APP等巴斯德桿菌科細菌的高效突變系統(tǒng)打下了基礎。最后,將復制溫敏型載體pGA318應用于APP脲酶C基因缺失的篩選,即將脲酶C基因的上下游同源臂克隆到pGA318中,然后利用同源重組的原理嘗試缺失APP的脲酶C基因,但