粘球菌內(nèi)源質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)、復(fù)制區(qū)性質(zhì)和應(yīng)用.pdf

1、粘細(xì)菌是一類革蘭氏陰性桿狀細(xì)菌，在分類上屬于變形菌門的δ分支。粘細(xì)菌是一種高等的原核生物，具有復(fù)雜的多細(xì)胞社會性行為，主要表現(xiàn)為介質(zhì)表面的滑動運(yùn)動、復(fù)雜的子實(shí)體形態(tài)發(fā)生和細(xì)胞生長的密度依賴性，因此粘細(xì)菌是研究細(xì)菌細(xì)胞間通訊、多細(xì)胞形態(tài)發(fā)生和生物進(jìn)化的重要模式生物。此外粘細(xì)菌可以產(chǎn)生豐富多樣的具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物.已成為繼放線菌之后的一類重要的藥源微生物。而且粘細(xì)菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物具有種類多、結(jié)構(gòu)新、具有菌株特異性、衍生物眾多和作

2、用于真核細(xì)胞的獨(dú)特特點(diǎn)，吸引了越來越多不同研究領(lǐng)域的科學(xué)家的關(guān)注。但是由于粘細(xì)菌繁瑣費(fèi)時的分離純化方法和不完善的遺傳操作技術(shù)，該微生物的研究和應(yīng)用受到了極大的限制。 由于粘細(xì)菌作為生境中的捕食者，細(xì)胞內(nèi)存在大量的蛋白酶和核酸酶，且粘細(xì)菌生長存在細(xì)胞密度依賴性，對粘細(xì)菌進(jìn)行遺傳操作遇到了很多困難。經(jīng)過過去三十年的研究，常用的遺傳學(xué)操作方法(轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化和接合)已在粘細(xì)菌的模式菌株中得到了成功應(yīng)用。然而在過去近五十年的時間中，科研工作

3、者雖然對粘細(xì)菌進(jìn)行了大規(guī)模篩選，但是在各種屬細(xì)胞中一直沒有發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性的質(zhì)粒，而且其他菌目來源的廣宿主范圍質(zhì)粒均不能在粘細(xì)菌中自主復(fù)制，所以粘細(xì)菌的遺傳學(xué)研究受到了極大限制。本論文試圖對中國生境內(nèi)已分離的粘細(xì)菌進(jìn)行篩選，希望能篩選到帶有自主復(fù)制質(zhì)粒的粘細(xì)菌，并將質(zhì)粒應(yīng)用于粘細(xì)菌的遺傳學(xué)研究，建立新的遺傳學(xué)操作方法。 本論文采用放線菌中常用的質(zhì)粒篩選方法，利用脈沖場電泳和瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)對本實(shí)驗(yàn)室分離的150株粘球菌和珊瑚球菌菌株

4、進(jìn)行線性質(zhì)粒和環(huán)形質(zhì)粒的篩選。結(jié)果顯示沒有篩選到線性質(zhì)粒，但在一株Myxococcus fulvus 124B02中發(fā)現(xiàn)了一個環(huán)形的內(nèi)源質(zhì)粒pMF1。該菌能形成典型的粘球菌子實(shí)體結(jié)構(gòu)，且16S rDNA序列與M.fulvus ATCC 25199的16S rDNA序列具有99％的同源性，中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號為M 206081。對質(zhì)粒pMF1亞克隆測序發(fā)現(xiàn)，該質(zhì)粒序列全長18,634 bp，G+C％含量為68.7％。ORF預(yù)測顯示

5、全序列存在23個可能的ORF，其中21個ORS位于正義鏈，2個ORS位于反義鏈：9個ORF與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列有較高同源性，其余的14個ORF同源性較低，是未知功能蛋白，沒有發(fā)現(xiàn)可能的質(zhì)粒復(fù)制起始蛋白。本論文構(gòu)建了一個帶有卡那霉素抗性篩選標(biāo)記的克隆載體pZJY1，用于在M.xanthus中定位pMF1的質(zhì)粒復(fù)制功能區(qū)。結(jié)果顯示凡是帶有pMF1.14基因的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化M. xanthus的轉(zhuǎn)化子均可以耐受卡那霉素，且存在核外自

6、主復(fù)制質(zhì)粒。質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化效率高于同源重組質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化效率，轉(zhuǎn)化M. xanthus DZ1可達(dá)到1×106 CFU/μg DNA，轉(zhuǎn)化M.xanthus DK.1622可達(dá)到1×105CFU/μg DNA，推測PMF1.14就是pMF1的質(zhì)粒復(fù)制起始蛋白，而質(zhì)粒pZJY15中帶有的pMF1插入序列(11，645-13,853 bp)可能就是pMF1質(zhì)粒復(fù)制功能區(qū)。在E. coli中對pMF1.14基因進(jìn)行異源表達(dá)，結(jié)果顯示除pQE-30

7、構(gòu)建的質(zhì)粒外，其他載體構(gòu)建的質(zhì)粒均可使轉(zhuǎn)化子經(jīng)過誘導(dǎo)產(chǎn)生目的大小的表達(dá)產(chǎn)物，以可溶性蛋白和包涵體的形式存在。 本論文發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的質(zhì)粒在M. xanthus轉(zhuǎn)化子中結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，會小于原始質(zhì)粒大小，通過克隆測序分析發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒中的不穩(wěn)定區(qū)域是E.coli質(zhì)粒pSP72的復(fù)制子與氨芐青霉素抗性基因bla序列，推測E. coli質(zhì)粒pSP72的復(fù)制子與M.fulvus質(zhì)粒pMF1的復(fù)制子在M. xanthus中不能共存。為了解決這個問題，對

8、帶有兩種復(fù)制子質(zhì)粒的M. xanthus轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了大量篩選，篩選到兩個在M. xanthus中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的質(zhì)粒pZJY41和pZJY156。而且在抗性篩選壓力下，M. xanthus轉(zhuǎn)化子連續(xù)傳代，兩質(zhì)粒結(jié)構(gòu)依然穩(wěn)定，克隆測序分析發(fā)現(xiàn)兩個質(zhì)粒帶有的pMF1插入序列部分均有1個堿基的缺失。 本論文在M. xanthus中對穿梭載體pZJY41和pZJY156進(jìn)行了性質(zhì)測定，這兩個質(zhì)粒在M. xanthus中均為低拷貝質(zhì)粒，在M.

9、xanthus DZ1中pZJY41的拷貝數(shù)為13左右，pZJY156的拷貝數(shù)低于pZJY41；而在M. xanthus DK1622中pZJY41和pZJY156的拷貝數(shù)要低于其各自在M. xanthus DZ1中的拷貝數(shù)。質(zhì)粒pZJY41和pZJY156在M. xanthus中的遺傳穩(wěn)定性很差，在沒有選擇壓力的情況下，傳代42代后質(zhì)粒在轉(zhuǎn)化子中的存在率降為5％以下。為提高穿梭載體在M. xanthus中的遺傳穩(wěn)定性，來自質(zhì)粒pMF1

10、的兩個ORF基因pMF1.16(推測的重組酶基因)和pMF1.22(推測的分配蛋白parA基因)克隆入兩個穿梭載體，獲得的質(zhì)粒在M. xanthus中的遺傳穩(wěn)定性依然很差，推測自主復(fù)制質(zhì)粒在M.xanthus中的分配可能依賴其他機(jī)制或蛋白的作用。構(gòu)建的帶有pMF1復(fù)制子的接合質(zhì)粒接合入Sorangium cellulosum So0157-2，與同源重組質(zhì)粒相比接合效率提高10-100倍，但是質(zhì)粒的遺傳穩(wěn)定性非常差，推測與S. cell

11、ulsoum中更為嚴(yán)格的限制修飾系統(tǒng)相關(guān)。為將pZJY41和pZJY156這兩個穿梭載體應(yīng)用于粘細(xì)菌的遺傳學(xué)研究，本論文開展了兩方面的工作，試圖在粘細(xì)菌中建立一套新的遺傳操作方法。 粘細(xì)菌的滑動運(yùn)動在Myxococcus xanthus中研究得較為成熟，受雙運(yùn)動系統(tǒng)控制：細(xì)胞的群體運(yùn)動(S運(yùn)動)和細(xì)胞的個體運(yùn)動(A運(yùn)動)。兩種運(yùn)動在含有不同濃度瓊脂的平板表面表現(xiàn)出不同的選擇優(yōu)勢，易于區(qū)分。其中細(xì)胞的群體運(yùn)動機(jī)制研究得較為透徹，主

12、要依賴細(xì)胞表面的IV型菌毛、胞外纖絲和脂多糖O抗原三種組分。S運(yùn)動的動力元件是IV型菌毛，依靠IV型菌毛的伸展、粘附、收縮拉動細(xì)胞共同運(yùn)動，而pilA基因是菌毛pili的結(jié)構(gòu)基因。本論文將M. xanthusDK1622來源的pilA基因及上游的σ54啟動子序列克隆入穿梭載體pZJY41和pZIY156構(gòu)建功能質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化pilA基因缺失的S運(yùn)動缺失突變體M. xanthusDK10410。通過透射電鏡觀察，轉(zhuǎn)化子細(xì)胞極處長出pili；運(yùn)

13、動學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)化子S運(yùn)動表型恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)表明應(yīng)用穿梭質(zhì)粒時，克隆目的基因的轉(zhuǎn)錄方向與pMF1質(zhì)粒復(fù)制起始蛋白的轉(zhuǎn)錄方向必須一致，M. xanthus轉(zhuǎn)化子中質(zhì)粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。該實(shí)驗(yàn)證明穿梭載體pZJY41和pZJY156可以成功應(yīng)用于粘細(xì)菌的遺傳學(xué)研究，在M. xanthus中建立了以核外質(zhì)粒形式回補(bǔ)缺失基因的新的遺傳學(xué)操作方法。 氨基糖甙類抗生素是一種重要的臨床藥用抗生素，微生物對氨基糖甙類抗生素產(chǎn)生的抗性機(jī)制除了常見的改變細(xì)胞通

14、透性、活性外排、靶點(diǎn)核酸替換及三種修飾氨基糖甙類抗生素的酶失活抗生素以外，又發(fā)現(xiàn)了一類對rRNA修飾的酶：16S rRNA甲基化酶和16S rRNA甲基轉(zhuǎn)移酶。這類酶可以使細(xì)胞對氨基糖甙類抗生素產(chǎn)生廣譜抗性，多由氨基糖甙類抗生素的產(chǎn)生菌株編碼產(chǎn)生，對rRNA甲基化修飾破壞抗生素與核糖體亞單位中16S rRNA的特異性結(jié)合。近年來該酶也在一些氨基糖甙類抗生素耐藥菌中發(fā)現(xiàn)。 粘細(xì)菌可以對多種抗生素產(chǎn)生抗性，多表現(xiàn)為菌株特異性，而S.

15、cellulosum對氨基糖甙類抗生素——卡那霉素的耐受性具有種特異性，但由于粘細(xì)菌中有限的遺傳學(xué)研究方法，該抗性機(jī)制的遺傳學(xué)基礎(chǔ)一直沒有闡明，本論文試圖利用pMF1復(fù)制子在M. xanthus中研究S. cellulosum對卡那霉素具有內(nèi)源抗性的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。本論文構(gòu)建了一個在M. xanthus中沒有篩選標(biāo)記但帶有pMF1復(fù)制子的克隆載體pZJY42，將不完全酶處理的S. cellulosum So0157-2的染色體片段克隆入pZ

16、JY42轉(zhuǎn)化M. xanthus DZ1，在卡那霉素抗性平板上篩選到5株M. xanthus轉(zhuǎn)化子。對克隆序列進(jìn)行序列測定和組裝，得到5.4 kb的S. cellulosum基因組片段，且各轉(zhuǎn)化子中均帶有一段2.4 kb的共有序列。對卡那霉素抗性基因進(jìn)行基因定位，發(fā)現(xiàn)該基因是一個推測的rRNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因，位于一個672 bp的基因位點(diǎn)kmr(kanamycin resistance)。凡是帶有該位點(diǎn)的質(zhì)粒均能使M.xanthus轉(zhuǎn)化

17、子對卡那霉素、慶大霉素、阿布拉霉素、新霉素和妥布霉素產(chǎn)生高水平的抗性(大于500 μg/ml)。但是帶有該位點(diǎn)的質(zhì)粒卻不能使E. coli轉(zhuǎn)化子對卡那霉素產(chǎn)生抗性，推測可能由于該基因的啟動子序列不能為E. coli識別轉(zhuǎn)錄，或基因中帶有的E. coli稀有密碼子不能有效翻譯。在S. cellulosum基因組序列中，kmr位點(diǎn)下游存在一個推測的整合酶基因，可能幫助kmr在S.cellulosum種間傳播。利用16S rRNA甲基轉(zhuǎn)移酶保