SsHADV--1影響核盤菌侵染油菜機制的解析.pdf

1、核盤菌是一種重要的植物病原真菌，且寄主廣泛，由其引起的菌核病危害嚴重，目前缺乏高效、綠色的防治手段。真菌病毒是侵染真菌的病毒，能夠引起寄主致病力衰退的真菌病毒是潛在的生物防治資源。國內(nèi)外學(xué)者已發(fā)現(xiàn)多種能夠引起核盤菌致病力衰退的病毒，DNA病毒SsHADV-1就是其中之一。SsHADV-1具有強侵染力，其病毒粒子可侵染核盤菌菌絲，擴散受到寄主營養(yǎng)體不親和性的影響小，具有良好的防治菌核病的前景。
　　為了研究SsHADV-1病毒引起核

2、盤菌致病力衰退的機制，我們運用RNA-Seq技術(shù)比較了攜帶SsHADV-1的菌株DT-8和不攜帶病毒的菌株DT-8VF在活體油菜葉片上基因表達的差異。收集DT-8和DT-8VF的菌絲片段懸液，分別接種在活體油菜植株的葉片上，置于20℃光照培養(yǎng)室保濕培養(yǎng)。在接種油菜6hpi、12hpi、18hpi和24hpi時收取菌絲提取總RNA，測序后得到各個樣本轉(zhuǎn)錄信息。
　　比較不同時間點時菌株DT-8中與菌株DT-8VF中基因的表達情況，在

3、核盤菌接種油菜6hpi時，菌株DT-8中顯著上調(diào)基因816個，顯著下調(diào)基因587個;12hpi時顯著上調(diào)基因795個，顯著下調(diào)基因835個;18hpi時顯著上調(diào)基因991個，顯著下調(diào)基因717個;24hpi時顯著上調(diào)基因981個，顯著下調(diào)基因756個。此外，在6hpi、12hpi、18hpi和24hpi時均顯著差異表達的基因達687個，其中上調(diào)基因435個，下調(diào)基因252個，下調(diào)的基因為次級代謝、聚糖代謝、蛋白結(jié)合、脂肪酸代謝相關(guān)等;均

4、上調(diào)的為DNA修復(fù)、DNA重組和復(fù)制等相關(guān)基因。
　　對顯著差異表達的基因進行GO功能分析、KEGG pathway富集分析，以及FunCat分析，結(jié)合三種分析方法可知，SsHADV-1的侵染主要影響了核盤菌自身的代謝途徑和DNA損傷修復(fù)反應(yīng)。其中顯著性上調(diào)的基因富集到的通路有:DNA損傷和修復(fù)以及DNA復(fù)制相關(guān)，侵染初期有氧化還原相關(guān)和轉(zhuǎn)運相關(guān)的通路，侵染后期與毒素轉(zhuǎn)運相關(guān)通路以及氮代謝相關(guān)基因顯著上調(diào)。顯著性下調(diào)的基因富集到的

5、通路為糖類代謝、脂類代謝、毒力因子以及解毒相關(guān)，碳水化合代謝通路和次級代謝通路相關(guān)基因在接種12hpi和18hpi時下調(diào)，菌株DT-8中糖基水解酶類（角質(zhì)酶、蛋白酶、細胞壁降解酶等，參與碳水化合物代謝）基因顯著下調(diào)。篩選獲得了在菌株DT-8中顯著下調(diào)的碳水化合物代謝酶類108個以及6個顯著下調(diào)的小分泌蛋白，對于這些可能參與了核盤菌致病過程的酶類和分泌蛋白需進行進一步的分析和驗證。
　　DNA病毒的侵染通常會激發(fā)寄主的DNA損傷修復(fù)

6、反應(yīng)，ku70和ku80是DNA損傷修復(fù)通路—非同源末端結(jié)合中的關(guān)鍵因子。與菌株DT-8VF相比，基因Ssku70和Ssku80在菌株DT-8侵染油菜6hpi、12hpi、18hpi和24hpi時上調(diào)達2倍至4倍，且菌株DT-8中這兩個基因的表達量隨時間遞推而增加，而菌株DT-8VF中4個時間點下表達量幾乎沒有變化。為了探究這兩個基因在核盤菌中的功能，本試驗運用PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法對菌株DT-8VF進行基因Ssku70和Ssku

7、80的敲除，Ssku70得到5個敲除轉(zhuǎn)化子，而Ssku80得到3個敲除轉(zhuǎn)化子，由于核盤菌細胞具有多核的特性，qRT-PCR驗證結(jié)果表明敲除轉(zhuǎn)化子中基因Ssku70和Ssku80仍有表達，但表達量顯著下降。對敲除轉(zhuǎn)化子進行生物學(xué)性狀的測定，發(fā)現(xiàn)基因Ssku70的敲除轉(zhuǎn)化子的菌落形態(tài)發(fā)生了明顯扇變，且菌絲更為致密，菌核形成速度減慢;而基因Ssku80的敲除轉(zhuǎn)化子氣生菌絲濃密，但菌核形成與菌株DT-8VF無明顯差異。致病力測定試驗結(jié)果表明所有

8、KU敲除轉(zhuǎn)化子的致病力均顯著下降，尤其是基因Ssku70的敲除轉(zhuǎn)化子致病力衰退更明顯，且Ssku70和Ssku80的敲除轉(zhuǎn)化子的致病力也存在統(tǒng)計學(xué)上的差異。推測Ssku70和Ssku80可能通過影響核盤菌的DNA損傷修復(fù)反應(yīng)而影響其致病力，但是對病毒傳播和積累的影響暫時未知。
　　本論文首次探究了病毒SsHADV-1、真菌與植物這三者互作過程中核盤菌代謝通路和基因的變化，發(fā)現(xiàn)破壞非同源末端結(jié)合通路中的Ssku70和Ssku80基因