核盤菌AOX基因的原核表達(dá)以及油菜BNWRKY40基因遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、油菜核盤菌是一種破壞力很強(qiáng)的植物病原真菌，嚴(yán)重威脅著油菜的產(chǎn)量和品質(zhì)。為了進(jìn)一步了解和防治該病害，本文做了以下兩方面的研究:
　　 1:交替氧化酶是真菌抗氰呼吸的末端氧化酶。為了在蛋白水平上研究核盤菌交替氧化酶的功能，我們用大腸桿菌表達(dá)了該基因，并制備了其多克隆抗體。首先以核盤菌cDNA為模板，通過(guò)PCR技術(shù)獲得其AOX基因3'端約350bp的序列，并將兩段該序列串連起來(lái)，將串連的序列克隆進(jìn)表達(dá)載體pET-32a中，在大腸桿菌B

2、L21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)出分子量約為45 kDa的融合蛋白。融合蛋白經(jīng)IMAC層析柱純化，得到高純度的融合蛋白。用純化蛋白免疫新西蘭白兔，獲得了融合蛋白的抗血清，間接ELISA法測(cè)定抗血清效價(jià)大于1∶500000。Western blot結(jié)果顯示抗血清不僅可以與融合蛋白特異性結(jié)合，還可與從核盤菌提取物中的交替氧化酶特異性反應(yīng)。因此所制備的抗血清可用于從蛋白水平上研究核盤菌交替氧化酶的功能。
　　 2:已有很多研究報(bào)道了WRKY

3、轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物應(yīng)對(duì)病原微生物脅迫當(dāng)中的作用，但卻鮮有關(guān)于油菜WRKY轉(zhuǎn)錄因子的研究。BnWRKY40是從油菜中新分離的一個(gè)WRKY類轉(zhuǎn)錄因子基因，文獻(xiàn)初步證實(shí)其在油菜受核盤菌侵染后表達(dá)會(huì)顯著上調(diào)。為了進(jìn)一步明確其在油菜抗核盤菌中的作用，我們擴(kuò)增了其編碼區(qū)序列，并將其編碼區(qū)分別正向和反向克隆進(jìn)植物表達(dá)載體pBin438，構(gòu)建了BnWRKY40基因的正義載體pBin438-BnWRKY40和反義載體pBin438-aBnWRKY40。將