基于熒光納米標記與介電泳技術(shù)的細胞體系檢測研究.pdf

1、細胞體系的檢測與食品安全檢測、疾病診斷、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域息息相關(guān),因此,快速、準確地檢測細胞體系具有舉足輕重的意義。目前,細胞體系檢測的常用方法主要包括熒光分析法、酶聯(lián)免疫分析法、生物傳感器、流式細胞術(shù)等。這些方法在縮短檢測時間、提高檢測靈敏度和準確性等方面作出了重要貢獻。然而,在將這些方法用于細胞體系檢測時,通常還存在著樣品需要預富集、信號強度受限制等缺陷。因此,待測樣品在同步檢測過程中實現(xiàn)有效分離與富集以及增強檢測過程中獲取信號的強度

2、對于建立快速、靈敏的細胞體系檢測新技術(shù)十分必要。近年來,具有高熒光強度和較好光穩(wěn)定性的熒光納米粒顆粒已被廣泛應用于生物醫(yī)學分析領(lǐng)域,相對于傳統(tǒng)的標記方法,功能化熒光納米顆粒標記技術(shù)能大大提高檢測靈敏度和光穩(wěn)定性;同時,介電泳理論和微電加工技術(shù)的快速發(fā)展,為樣品中少量細胞作為對象的超靈敏檢測提供了新的契機。本論文瞄準細胞體系的快速、靈敏檢測這一重要研究方向,在對細胞體系主要是病原菌細胞和腫瘤細胞檢測方法進行簡要綜述的基礎上,以熒光納米顆粒

3、標記、核酸適體探針識別特性與介電泳富集技術(shù)用于大腸桿菌O157:H7、CEM細胞等重要細胞的快速、靈敏檢測為主線,主要開展了以下幾個方面的研究工作:
　　 1、生物修飾的熒光二氧化硅納米顆粒對大腸桿菌O157:H7介電性質(zhì)的影響
　　 設計并利用拋物線電極研究了生物修飾的熒光二氧化硅納米顆粒結(jié)合到大腸桿菌O157:H7表面后對大腸桿菌O157:H7介電性質(zhì)所產(chǎn)生的影響。通過考察50 KHz-100 MHz的頻率范圍內(nèi)大腸

4、桿菌O157:H7和表面結(jié)合了生物修飾的二氧化硅納米顆粒后的大腸桿菌O157:H7的介電泳行為,發(fā)現(xiàn)大腸桿菌O157:H7在50 KHz-80 MHz頻率范圍內(nèi)表現(xiàn)為正介電泳行為,在90MHz-100MHz頻率范圍內(nèi)表現(xiàn)為負介電泳行為;結(jié)合了生物修飾的二氧化硅納米顆粒后的大腸桿菌0157:H7在50KHz-60MHz頻率范圍內(nèi)表現(xiàn)為正介電泳行為,在70MHz-100MHz頻率范圍內(nèi)表現(xiàn)為負介電泳行為。研究結(jié)果表明結(jié)合生物修飾的熒光二氧化

5、硅納米顆粒后,大腸桿菌O157:H7的正負介電泳的臨界頻率從90MHz變成70MHz,生物修飾的納米顆粒結(jié)合在大腸桿菌O157:H7表面后對大腸桿菌O157:H7的介電性質(zhì)產(chǎn)生了一定影響。該研究工作為用介電泳富集技術(shù)快速、靈敏檢測大腸桿菌O157:H7細胞打下了實驗基礎。
　　 2、基于介電泳富集技術(shù)和熒光納米顆粒信號增強的微流控大腸桿菌O157:H7檢測研究
　　 在研究生物修飾的熒光二氧化硅納米顆粒對大腸桿菌O157

6、:H7介電性質(zhì)的影響基礎上,提出了一種結(jié)合熒光納米顆粒標記和介電泳在線富集技術(shù)的快速、靈敏、方便的微流控檢測病原菌新方法。以大腸桿菌O157:H7為檢測對象,通過采用具有信號增強作用的包裹釕吡啶熒光染料的羧基化二氧化硅納米顆粒修飾識別大腸桿菌O157:H7的特異性抗體,實現(xiàn)對大腸桿菌O157:H7的選擇性結(jié)合與識別,在此基礎上,在特定頻率的交流電場下,利用設計的微流控芯片對標記生物修飾的熒光納米顆粒的大腸桿菌O157:H7進行定向富集,

7、再通過測量富集區(qū)域熒光信號的強度,實現(xiàn)對大腸桿菌O157:H7進行定量檢測。由于未與大腸桿菌O157:H7結(jié)合的納米顆粒不會表現(xiàn)正介電泳行為,在微流控芯片中直接被沖走。因此,這種新方法成功地將需要去除多余熒光納米顆粒的分離與洗滌過程整合到檢測過程中。該方法對大腸桿菌O157:H7檢測的線性范圍為4.2x102～4.2×106cfu/mL,對去離子水中大腸桿菌O157:H7的檢測限為64cfu/mL。同時,我們在人工污染的實際水樣品中能精

8、確檢測到420cfu/mL的大腸桿菌O157:H7。該方法的整個檢測過程可以在80min內(nèi)完成,為實現(xiàn)在食物、水中和環(huán)境樣品快速、靈敏、低成本地檢測病原菌的方法提供了契機。
　　 3、基于介電泳富集技術(shù)和Aptamer識別特性的CEM細胞檢測研究
　　 將核酸適體探針(Aptamer)對腫瘤細胞的特異性識別與結(jié)合作用和介電泳富集技術(shù)相結(jié)合,發(fā)展了一種新型的基于核酸適體探針識別特性與介電泳富集技術(shù)的CEM細胞檢測方法。通過

9、采用FAM-sgc8c核酸適體探針對目標CEM細胞進行特異性識別后,將其加入到設計好的電極芯片上,用波形/函數(shù)發(fā)生器提供一定的電壓與頻率,通過介電泳力將FAM-sgc8c識別的CEM細胞富集在檢測區(qū)域,采用熒光顯微鏡對聚集的CEM細胞進行熒光成像檢測。結(jié)果表明,該方法可以成功應用于在緩沖液體系中檢測CEM細胞,檢測線性范圍是8.1×104-1.2×106cells/mL,在10μL5％蔗糖溶液的緩沖液中最低可檢測到1200個CEM細胞。