肝腎組織培養(yǎng)微流控芯片的構建及其在腫瘤外泌體器官趨向性研究中的應用.pdf

1、目的:構建基于微流控芯片的肝腎組織培養(yǎng)技術平臺，進而在該平臺上研究腫瘤細胞外泌體在腫瘤轉移中的作用。
　　方法:本實驗采用常規(guī)紫外光刻膠技術制備SU-8模板，灌注聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)，獲得微流控芯片的膜片，打孔后使用預聚物熱固化的方法完成膜片與多孔膜的封接，夾具夾緊備用。本實驗所用細胞包括人臍靜脈血管內皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell

2、，HUVEC)、乳腺癌(Breast cancer,BC)細胞系MDA-MB-231和MCF7，分別使用ECM、L-15、DMEM/F12培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。微流控芯片組織培養(yǎng)池底部用1:8的Matrigel(BD公司)包被后接種HUVEC，待細胞生長達到緊密連接，使用分子量為10kDa的FITC-Dextran評價其滲透性。實驗動物選取1～2周齡SD大鼠，麻醉后取大鼠的肝和腎組織，使用徠卡活組織振動切片機VT1200S制備直徑5mm厚度2

3、50μm的精密組織切片(Precision-cut Tissue Slices，PTS)本文中包括精密肝切片(Precision-cut Liver Slices，PLS)、精密腎切片(Precision-cut Kidney Slices，PKS)，置于微流控芯片組織培養(yǎng)池內培養(yǎng)。采用注射泵驅動微通道內的培養(yǎng)液以0.75μL/min恒定流速對PTS進行灌流培養(yǎng)24h后將培養(yǎng)的PLS、PKS各分為兩組，一組用Hoechst33342、R

4、h-123和PI聯(lián)合染色，直接鑒定PTS內的細胞活性;另外一組多聚甲醛固定，OCT包埋，蘇木精和伊紅染色檢查組織結構的完整性，使用Ki67抗體進行免疫熒光染色考察細胞的增殖能力，CXCL12抗體進行免疫熒光染色檢測PTS趨化因子分泌功能。采用培養(yǎng)0h的PTS作為對照組。收集MDA-MB-231和MCF7細胞培養(yǎng)48h的培養(yǎng)基，采用商品化外泌體提取試劑盒Total Exosome Isolation分別提取兩種細胞分泌的外泌體。透射電鏡成

5、像觀察外泌體形態(tài)。蛋白質印跡法(Western Blot，WB)鑒定外泌體蛋白表達，具體檢測指標包括CD63、CD81、Hsp70、CXCR4、GAPDH。將PKH67標記的MDA-MB-231外泌體加入PTS培養(yǎng)微流控芯片內，與PTS共孵育30min、60min，之后考察外泌體的組織趨向性。動物實驗選取2周齡的SD大鼠，鼠尾靜脈注射PKH67標記的MDA-MB-231外泌體(10μg)，24h后麻醉大鼠，取肝、腎組織，多聚甲醛固定，O

6、CT包埋，制備冰凍切片，DAPI染色，檢查外泌體的組織趨向性。利用ELISA試劑盒分別檢測PLS、PKS的CXCL12分泌量。外泌體組織趨向抑制實驗選取CXCR4受體拮抗劑AMD3100，使用梯度濃度的AMD3100與MDA-MB-231外泌體孵育過夜，然后將外泌體加入PTS培養(yǎng)微流控芯片通道內與組織培養(yǎng)池內的PTS共孵育，考察外泌體的肝趨向性抑制情況。動物實驗選取2周齡SD大鼠，在10μg/100μL熒光標記MDA-MB-231外泌體

7、稀釋液體系中，加入AMD3100使其終濃度達2μg/mL后共孵育過夜，鼠尾靜脈注射，24h后麻醉大鼠，取肝和腎組織檢查外泌體的組織趨向性。
　　結果:本研究構建的PTS培養(yǎng)微流控芯片從下向上依次為:下層PDMS膜片，蝕刻有微通道;聚碳酸酯膜，布滿8μm孔徑的微孔;中間層PDMS膜片，有2個組織培養(yǎng)池;頂層PDMS膜片，用于封閉組織培養(yǎng)池;整體使用夾具夾緊備用。將大鼠的肝和腎組織制成直徑5mm、厚度250μm的PTS，在PTS培養(yǎng)微

8、流控芯片的培養(yǎng)池內灌流培養(yǎng)24h。與體外培養(yǎng)0h的對照組PTS相比較，Hoechst33342、Rh-123和PI聯(lián)合染色顯示兩種PTS內的細胞均保持良好的活性，活性率達90％以上;HE切片顯示兩種PTS均保持完整的組織結構;Ki67染色結果顯示PTS內的細胞保持良好的增殖能力;CXCL12染色結果顯示PTS保有趨化因子分泌功能。這部分結果提示基于微流控芯片的PTS培養(yǎng)，至少在24h內可以維持PTS的細胞活性、組織形態(tài)結構、細胞增殖能力

9、和趨化因子分泌功能。進而，基于該微流控芯片考察了腫瘤細胞外泌體的組織趨向性。從MDA-MB-231和MCF7細胞培養(yǎng)液中分離獲得外泌體，電鏡檢查結果顯示外泌體為標準茶托狀雙層膜結構，WB結果顯示外泌體表達典型的標志物，如CD63、CD81、Hsp70蛋白等。基于微流控芯片的外泌體組織趨向性實驗結果顯示，與腎組織比較，MDA-MB-231外泌體(p＜0.001)和MCF7外泌體(p＜0.01)具有明顯的肝趨向性，且高轉移細胞MDA-MB-

10、231比低轉移細胞MCF7的肝趨向性更強(p＜0.001)。大鼠體內實驗結果顯示，MDA-MB-231(p＜0.0001)和MCF7(p＜0.0001)外泌體具有明顯的肝趨向性，在腎組織幾乎找不到這兩種細胞的外泌體，而且在肝組織MDA-MB-231外泌體顯著多于MCF7外泌體(p＜0.0001)。CXCR4免疫熒光染色和WB結果均顯示兩種BC細胞均高表達CXCR4，而且WB結果顯示BC細胞外泌體表達CXCR4。此前，已經(jīng)分別利用免疫熒光

11、染色法和ELISA試劑盒法證實了PLS中及其分泌的CXCL12量顯著高于PKS。這一結果提示CXCL12/CXCR4生物軸可能在BC細胞外泌體的肝趨向性中發(fā)揮一定作用。因此，使用梯度濃度的CXCR4受體拮抗劑AMD3100處理MDA-MB-231外泌體后，在微流控芯片上考察了AMD3100對MDA-MB-231外泌體肝趨向的拮抗作用，結果發(fā)現(xiàn)隨AMD3100濃度升高MDA-MB-231外泌體的肝趨向性顯著降低，呈明顯劑量依賴(0.5μg

12、/mL，p＜0.05;1μg/mL，p＜0.01;2μg/mL，p＜0.001)。大鼠實驗同樣證實AMD3100可有效抑制MDA-MB-231外泌體在肝組織的定植灶數(shù)量(p＜0.05)。
　　結論:(1)本研究構建了PTS培養(yǎng)的微流控芯片及其操作方法，基于該芯片的PTS培養(yǎng)24h內可良好地保持細胞活性、組織結構完整性、細胞增殖能力和趨化因子分泌功能。(2)微流控芯片PTS培養(yǎng)和動物實驗結果均證實BC細胞外泌體具有明顯的肝趨向性。(