乙型肝炎病毒體外感染模型的構(gòu)建、優(yōu)化及初步應(yīng)用.pdf

1、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是危害人類健康的重要公共衛(wèi)生問題，盡管現(xiàn)有的預(yù)防性疫苗已顯著減少了新發(fā)HBV感染，全球仍有約2.4億的慢性HBV感染者需要得到有效的治療。鑒于現(xiàn)有慢乙肝治療藥物只能控制病情發(fā)展而難以實(shí)現(xiàn)臨床治愈，發(fā)展更加有效的Anti-HBV新藥是當(dāng)前HBV的研究重點(diǎn)方向。建立和發(fā)展能實(shí)現(xiàn)HBV完整生命周期的細(xì)胞和動(dòng)物模型對(duì)Anti-HBV治療新技術(shù)的發(fā)展至關(guān)重要。其中，支持HBV感染和復(fù)制

2、的細(xì)胞模型是研究HBV與宿主相互作用、篩選和評(píng)估HBV感染治療藥物、評(píng)估抗體中和活性的重要工具。除原代肝細(xì)胞外，分化的HepaRG細(xì)胞與外源表達(dá)HBV功能性受體人鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Sodium taurocholate cotransportingpolypeptide，NTCP）的HepG2細(xì)胞(HepG2-NTCP)是目前最為常用的兩種HBV易感細(xì)胞，但現(xiàn)有基于上述兩種細(xì)胞的體外HBV感染系統(tǒng)尚存在感染效率低、操作繁瑣等不

3、足，有待進(jìn)一步改進(jìn)。本研究擬通過(guò)構(gòu)建新的HBV易感細(xì)胞株、篩選能增強(qiáng)HBV感染的小分子促進(jìn)劑和優(yōu)化感染條件等手段建立更為高效的HBV細(xì)胞感染模型，并初步應(yīng)用于Anti-HBV藥物的篩選評(píng)估和慢性乙肝病人血清病毒感染性與其治療應(yīng)答相關(guān)性的探索。
　　本研究分為兩個(gè)部分，分別對(duì)基于HepG2-NTCP和HepaRG的HBV體外感染模型進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化和應(yīng)用探索。其中第一部分針對(duì)是HepG2-NTCP細(xì)胞模型的構(gòu)建、優(yōu)化和應(yīng)用。人鈉離子-牛

4、磺膽酸共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是HepG2細(xì)胞中缺少的HBV功能性受體。2012年，Huan Yan等最早發(fā)現(xiàn)在HepG2、Huh7等人肝癌細(xì)胞株中外源性表達(dá)NTCP可使其獲得HBV易感性，為構(gòu)建新的HBV體外感染模型奠定了基礎(chǔ)。但此前報(bào)道的基于HepG2-NTCP細(xì)胞株的體外感染模型感染效率較低，僅為10-20％左右，且對(duì)病人血清HBV的易感性較差。本研究從下述三個(gè)方面對(duì)基于HepG2-NTCP細(xì)胞的感染模型進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化，包括:(1)構(gòu)建了四環(huán)素

5、誘導(dǎo)表達(dá)型的HepG2-NTCP細(xì)胞株，將NTCP編碼序列與IRES驅(qū)動(dòng)的紅色熒光蛋白(mCherry)構(gòu)建于四環(huán)素誘導(dǎo)啟動(dòng)子調(diào)控的雙順反子表達(dá)框中，利用慢病毒系統(tǒng)將該表達(dá)框穩(wěn)定整合至HepG2-TetOn細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞分選和細(xì)胞克隆化獲得了穩(wěn)定整合的HepG2-2B1細(xì)胞株。該細(xì)胞株在Doxycycline(Dox)誘導(dǎo)后，能高水平表達(dá)NTCP，并支持HBV感染，感染率為30％左右。(2)評(píng)估了系列小分子化合物對(duì)HBV體外感染的作

6、用。發(fā)現(xiàn)采用9-cis-RA和CD437兩種維甲酸受體(Retinoic acid receptors，RAR)激動(dòng)劑類藥物處理HepG2-2B1細(xì)胞，能顯著提高其對(duì)HBV的易感性。其中，9-cis-RA需要與DMSO聯(lián)合使用，而CD437則無(wú)需DMSO協(xié)同即可大幅提高感染后細(xì)胞的HBV抗原(HBeAg和HBsAg)表達(dá)水平、HBcAg免疫熒光染色陽(yáng)性率及細(xì)胞內(nèi)外病毒DNA/RNA水平。(3)優(yōu)化了感染程序，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞處于懸浮狀態(tài)時(shí)進(jìn)行

7、HBV孵育（懸浮感染）可顯著提高易感性，并可與藥物處理產(chǎn)生協(xié)同增強(qiáng)作用。通過(guò)以上三個(gè)方面的改進(jìn)，我們建立了基于HepG2-NTCP的HBV高效感染體系，其中CD437處理的懸浮感染條件，可將HBV感染HepG2-2B1細(xì)胞的感染率（感染后第12天細(xì)胞HBcAg免疫熒光染色陽(yáng)性率）從34.5％提升到98.3％，同時(shí)顯著提高（＞5倍以上）感染后細(xì)胞的HBsAg、HBeAg分泌水平及胞內(nèi)HBV RNA（包括pgRNA和total HBV RN

8、A）、HBV DNA（包括core DNA和cccDNA）水平。
　　為研究?jī)?yōu)化感染條件促進(jìn)HBV感染的分子機(jī)制，筆者采用報(bào)告基因方法和mRNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析了藥物處理對(duì)外源及內(nèi)源基因表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示，CD437處理可顯著增強(qiáng)多種外源啟動(dòng)子活性(CMV、CAG、SV40、CMVTRE3G)，從而增強(qiáng)其下游基因表達(dá)水平。此外，研究還發(fā)現(xiàn)CD437處理能同時(shí)增強(qiáng)轉(zhuǎn)染了HBV1.3倍基因組克隆的HepG2細(xì)胞的HBeAg和HBs

9、Ag表達(dá)水平，表明其對(duì)HBV啟動(dòng)子也有促進(jìn)作用。對(duì)DMSO、DMSO+9-cis-RA、CD437處理后HepG2-HepG2-2B1細(xì)胞進(jìn)行mRNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)果顯示相比于未處理細(xì)胞，DMSO、CD437處理均可顯著增強(qiáng)包括NTCP在內(nèi)的多個(gè)與HBV感染及早期復(fù)制相關(guān)的宿主基因的轉(zhuǎn)錄水平。筆者構(gòu)建了藥物處理后顯著上調(diào)的14個(gè)基因的cDNA表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HepG2-HepG2-2B1細(xì)胞進(jìn)行感染驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中9個(gè)基因(BCL2A1

10、、BCL2L1、NUP155、CHORDC1、PON2、TRIM26、SART3、MTA2、HNF4A)的過(guò)表達(dá)可以增強(qiáng)HBV在HepG2-2B1細(xì)胞中的感染。綜上所述，筆者的研究結(jié)果表明CD437增強(qiáng)HBV感染復(fù)制相關(guān)宿主基因的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)HBV的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而起到增強(qiáng)HBV感染的效果。
　　進(jìn)一步評(píng)估發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化后的HepG2-2B1感染體系可以支持HBV攜帶者血清的直接感染分析，為進(jìn)一步分析慢性乙肝病人血清病毒感染性特征提

11、供了重要工具。采用此模型，本研究對(duì)104例接受長(zhǎng)效干擾素治療的HBeAg陽(yáng)性的慢性乙肝患者基線血清病毒（HBV DNA水平均大于108 copies/mL）的體外感染能力進(jìn)行了評(píng)估，其中42(40.3％)例基線血清可檢測(cè)到感染后HBeAg水平的升高（成功感染標(biāo)志）。結(jié)合基線血清能否實(shí)現(xiàn)體外成功感染與長(zhǎng)效干擾素治療應(yīng)答結(jié)局進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)HBeAg陽(yáng)性的慢乙肝病人基線血清病毒感染性與干擾素治療后發(fā)生聯(lián)合應(yīng)答(HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換及HBV D

12、NA降至檢測(cè)下限)具有顯著的相關(guān)性，基線血清病毒感染性越弱，干擾素治療后越容易發(fā)生聯(lián)合應(yīng)答。因此，基線病毒感染性可能可以作為預(yù)測(cè)干擾素治療應(yīng)答的另一個(gè)指標(biāo)。在本研究中，qAnti-HBc預(yù)測(cè)干擾素治療后發(fā)生聯(lián)合應(yīng)答的AUROC值為0.677(95％ CI:0.576-0.779，p＜0.001)，基線病毒感染力預(yù)測(cè)的AUROC為0.663(95％ CI:0.558-0.767，p＜0.001)，而兩者聯(lián)合預(yù)測(cè)的AUROC值為0.724(

13、95％ CI:0.626-0.821，p＜0.001)。因此，兩者聯(lián)合預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性高于qAnti-HBc或基線病毒感染力單獨(dú)作為預(yù)測(cè)指標(biāo)的準(zhǔn)確性。
　　本研究第二部分是基于HepaRG細(xì)胞的HBV體外感染模型的優(yōu)化和初步應(yīng)用。HepG2細(xì)胞惡性程度較高，許多先天免疫應(yīng)答相關(guān)信號(hào)通路缺失，不適合用于宿主對(duì)HBV感染的先天免疫應(yīng)答機(jī)制的研究，本部分研究旨在構(gòu)建一個(gè)更接近原代肝細(xì)胞的細(xì)胞模型，與HepG2-2B1形成優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)。通過(guò)對(duì)He

14、paRG進(jìn)行基因改造，將HNF4A和FoxM1基因整合至HepaRG細(xì)胞，篩選獲得一株不依賴于DMSO即可完成分化并支持HBV感染的HepaRG-M14A細(xì)胞株。與原始HepaRG相比，HepaRG-M14A生長(zhǎng)分化速率更快，并且全部分化成為類肝細(xì)胞而不基本向類膽管細(xì)胞方向分化。分化兩周后的HepaRG-M14A細(xì)胞肝細(xì)胞特異基因的表達(dá)顯著提升且具有成熟肝細(xì)胞的功能，并且能夠在FRG小鼠中較快建立生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)重建。
　　分化兩周

15、的HepaRG-M14A與HepaRG相比，NTCP及多個(gè)與HBV感染及早期復(fù)制相關(guān)的基因的表達(dá)均有不同程度的提升，且無(wú)須DMSO誘導(dǎo)即可支持HBV的感染。懸浮感染和病毒孵育時(shí)添加DMSO可以提升HepaRG-M14A細(xì)胞對(duì)HBV的易感性。利用HepaRG-M14A細(xì)胞對(duì)HBV感染先天免疫應(yīng)答相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染早期存在較為短暫、微弱的的干擾素反應(yīng)和干擾素誘導(dǎo)基因(Interferon stimulated genes，ISGs)

16、的表達(dá)，JAK/STAT和NF-κB信號(hào)通路都參與到HBV的免疫應(yīng)答中。HepaRG-M14A細(xì)胞中模式識(shí)別受體(Pathogenrecognition receptor，PRR)的表達(dá)與HepG2相比更接近于原代肝細(xì)胞，大部分PRR激動(dòng)劑在M14A細(xì)胞中都具有抑制HBV感染的作用，其中抑制效果最顯著的是TLR-1/2，3，4，2/6和RIG-I/MDA-5的激動(dòng)劑。
　　綜上所述，本研究建立并發(fā)展了兩種不同的HBV體外感染模型和