彎孢屬種分子鑒定體系的建立及其在疑難種上的應用.pdf

1、彎孢屬(Curvularia)真菌多生于禾本科植物,是重要的植物病原菌,對其準確鑒定,是診斷植物病害的需要,也是進行該屬真菌系統(tǒng)演化研究的基礎。彎孢屬的部分種受環(huán)境影響變異較大,通過形態(tài)特征對其分類有一定的隨意性。
　　 本研究以形態(tài)特征為基礎,分析適合真菌分類的部分基因在彎孢屬種內、種間的變異性和保守性,篩選出適合彎孢屬種分類的基因,初步建立彎孢屬種分子鑒定體系,同時結合形態(tài)特征對彎孢屬的疑難種準確鑒定。
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2、8—2011年,從全國各地采集標本1000余份,所有標本經(jīng)保濕培養(yǎng)、組織分離,得到部分彎孢屬真菌,加上本實驗室保存的及從國內外同行、研究機構惠贈的彎孢屬菌株,共獲得近350個彎孢屬菌株。對收集到的所有彎孢屬菌株進行標準培養(yǎng)、形態(tài)特征觀察,根據(jù)形態(tài)特征鑒定出彎孢屬真菌23個已知種和3個未知種。
　　 在形態(tài)分類的基礎上,篩選出形態(tài)穩(wěn)定的彎孢屬14個種40個菌株,利用7個候選基因(5.8S/ITS、Gpd、Brnl、大亞基rRNA

3、D1/D2、ACT,CAL和EF-1α)的特異引物(CAL特異引物為本研究設計),對所有供試菌株進行PCR擴增、純化,測序,分析所有供試彎孢屬菌株種內、種間各基因的變異性與保守性,同時結合供試菌株的7個候選基因PCR擴增率及其序列成功獲取率,篩選出適合彎孢屬種分類的基因條碼。
　　 本研究成功獲得彎孢屬供試菌株7個候選基因序列共計255條。其中供試彎孢屬菌株的rDNA5.8S/ITS、rDNA D1/D2、Gpd和ACT基因PC

4、R擴增及其序列成功獲取率均高達100％,彎孢屬種內、種間Gpd,ACT基因保守性和變異相對穩(wěn)定,能夠準確區(qū)分參試彎孢屬種,可作為彎孢屬種間鑒定理想的基因條碼；rDNA5.8S/ITS基因序列比Gpd和ACT更保守,但對多數(shù)種可以區(qū)分,對個別相似種不能區(qū)分,該基因作為真菌分類鑒定主要的分子依據(jù)已經(jīng)被多數(shù)專家、學者認可,GenBank中物種序列最多,因此在彎孢屬分子鑒定體系中,該基因可作為首選基因；CAL、EF-1α基因也能將彎孢屬多數(shù)種明

5、確區(qū)分,但其PCR擴增和序列成功獲取率相對低于Gpd、ACT基因,在彎孢屬分子鑒定體系中可作為補充基因,增加彎孢屬種間遺傳信息量。Brnl基因的PCR擴增和序列成功獲取率較低(55％),大亞基rDNA D1/D2核苷酸序列高度保守,不能將彎孢屬多數(shù)種明確區(qū)分,不適合彎孢屬種間鑒定。
　　 研究過程中發(fā)現(xiàn)的三個未知種,經(jīng)過形態(tài)特征和遺傳信息分析,最終將其確定為彎孢屬的三個新種,并將其分別命名為:ZMJ23:Curvularia t

6、rifolicola Meng Zhang,T.Tsukiboshi&C.L.Wang,sp.nov.；ZM10088:Curvularia fatsia Meng Zhang&C.L.Wang,sp.nov；ZM10255-1:Curvularia fujianensis Meng Zhang&C.L.Wang,sp.nov.
　　 本研究建立的以rDNA5.8S/ITS、Gpa、ACT為首選基因,CAL、EF-1α為候補基因