DNA微條形碼技術(shù)在常見家禽家畜種屬鑒定中的應(yīng)用及其法醫(yī)學(xué)意義.pdf

1、前言：
　　種屬鑒定是法醫(yī)物證鑒定的一個重要環(huán)節(jié)。核外基因組DNA的一些區(qū)域不僅可作為種屬鑒定的理想目的基因，對于毛發(fā)、骨骼、牙齒等特殊生物檢材，以及生物檢材中細(xì)胞核DNA量不足而無法進(jìn)行分型時，核外基因組DNA分析就成為唯一可以利用的技術(shù)手段，并且微條形碼技術(shù)短片段的優(yōu)勢可以有效應(yīng)對法醫(yī)實踐中降解檢材的難題。近年來DNA條形碼技術(shù)作為生物分類方法學(xué)的后起之秀已被廣泛應(yīng)用。
　　生命DNA條形碼協(xié)會對DNA條形碼的定義:DN

2、A條形碼即一短段能夠高效鑒定物種的DNA標(biāo)準(zhǔn)區(qū)域。法醫(yī)領(lǐng)域中經(jīng)常會遇到腐敗檢材，生物檢材發(fā)生降解以后，DNA也發(fā)生斷裂，無法提取出完整的條形碼基因，這時微條形碼技術(shù)就又為我們提供了一條技術(shù)通路。微條形碼:在一些特殊領(lǐng)域（如法醫(yī)）中，標(biāo)本的DNA已經(jīng)降解，無法提取完整長度的COI基因，提取到部分COI基因(微條形碼短到100bp-300bp)也可以準(zhǔn)確鑒定物種。研究顯示，全長DNA條形碼鑒別準(zhǔn)確度最高，為97％，而5，端100bp的區(qū)域鑒

3、別度為90％，250bp區(qū)域為95％。
　　從DNA條形碼技術(shù)最初提出到實際應(yīng)用，其發(fā)展十分迅猛。2005年在倫敦召開了第一屆全球DNA條形碼會議，對DNA條形碼的分類概念、實驗技術(shù)的細(xì)節(jié)分析以及資源庫建立等議題進(jìn)行了討論。BOLD網(wǎng)站收錄的DNA條形碼信息總量超過130多萬條，但其中具有準(zhǔn)確的物種信息和DNA序列信息的完整物種DNA條形碼信息僅有19163種。
　　我國DNA條形碼技術(shù)的研究報道多見于昆蟲類（醫(yī)學(xué)媒介生物）

4、、海洋生物、鳥類和少部分爬行類、哺乳類。日常生活中常見偶蹄目、奇蹄目和食肉目等哺乳類動物研究較少。因此，本研究擬采用DNA條形碼技術(shù)，研究我國常見家禽家畜的DNA條形碼數(shù)據(jù)，進(jìn)一步豐富生物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫信息，為司法鑒定應(yīng)用及其他領(lǐng)域的研究提供必須的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。建立更加簡便、快速、準(zhǔn)確的基于DNA條形碼技術(shù)的種屬鑒定方法，為解決司法鑒定中腐敗、降解生物檢材的種屬鑒定提供簡單有效的科學(xué)手段。
　　料和方法：
　　1、樣本來源<

5、br>　　常見家禽:雞、鴨、鵝、鵪鶉、鴿子血液樣本;
　　常見家畜:水牛、黃牛、山羊、綿羊、豬、馬、驢肌肉組織，犬（阿拉斯加犬、金毛獵犬、比熊犬、泰迪犬、西施犬）血液;人血液樣本。以上樣本各五例，其中除水牛樣本采自廣西宜賓地區(qū)外其余均采自沈陽地區(qū)。人血液樣本由中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)血清教研室提供。
　　2、樣本處理
　　(1)取同一濃度相同體積的DNA，采取200W功率、20Hz頻率的超聲波分別加以處理1、3、6、9、12、

6、15次以制備降解檢材。
　　(2)兩種動物DNA按照1∶10、1∶20、1∶50、1∶100比例混合以制備混合檢材。
　　3、實驗方法
　　采用有機(jī)溶劑法提取基因組DNA，紫外分光光度法檢測DNA含量。自行篩選引物擴(kuò)增人基因組CO1序列，應(yīng)用共同區(qū)PCR和測序技術(shù)分析的CO1的種屬差異。自行篩選引物擴(kuò)增動物基因組種屬特異性CO1序列，聚丙烯酰胺凝膠電泳-熒光染色技術(shù)分析單一擴(kuò)增體系的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性并檢測復(fù)合PC

7、R擴(kuò)增體系的特異性及其對混合樣本的檢出能力。
　　結(jié)果：
　　1、應(yīng)用自行設(shè)計的CO1基因共同區(qū)引物構(gòu)建的共同區(qū)PCR分析方法，成功擴(kuò)增了黃牛、水牛、豬、山羊、綿羊、雞、鴨、鵝、鴿子、鵪鶉、馬、驢、犬（阿拉斯加犬、比熊犬、泰迪犬、金毛獵犬、中華田園犬、西施犬）共13種哺乳動物CO1基因，人均未檢出相應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物，因此根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的有無可以正確判定它們的種屬來源。共同區(qū)PCR分析方法的靈敏度檢驗結(jié)果表明，鳥綱和偶蹄目動物擴(kuò)增體系

8、對模板的最低檢出量1ng，奇蹄目和犬科動物擴(kuò)增體系對模板的最低檢出量為0.5ng。共同區(qū)PCR穩(wěn)定性檢驗結(jié)果顯示，血液和肌肉組織可獲得成功擴(kuò)增。
　　2、應(yīng)用自行構(gòu)建的CO1基因復(fù)合擴(kuò)增體系對鳥綱、偶蹄目、奇蹄目、犬科共4組動物擴(kuò)增均獲得相應(yīng)的目的基因片段，無非特異性擴(kuò)增。應(yīng)用CO1基因復(fù)合擴(kuò)增體系檢驗混合樣本時，較低組分的最小檢出比例為1∶50。
　　3、將13種動物PCR產(chǎn)物測序結(jié)果進(jìn)行Blast，其中10種與本種內(nèi)動物

9、的匹配度最高，鴨、鴿、鵪鶉與原雞序列相似度最高。計算遺傳距離，家犬（種內(nèi)）遺傳距離小于1％，馬屬（屬內(nèi)種間）3.4％、雁屬（屬內(nèi)種間）11.4％、?？疲苾?nèi)屬間）9.3％。建立遺傳樹結(jié)果與傳統(tǒng)分類學(xué)基本一致。
　　結(jié)論：
　　1、本研究構(gòu)建的CO1基因共同區(qū)PCR分析方法，種屬特異性好，靈敏度高(0.5ng～1ng)，穩(wěn)定性好，可同時鑒定常見生物檢材的種屬，在法醫(yī)物證學(xué)中具有一定的應(yīng)用價值。
　　2、本研究構(gòu)建的CO1