華南地區(qū)常見藥用蛇類的DNA條形碼研究及其在金錢白花蛇鑒定上的應(yīng)用.pdf

1、中藥是中華民族的一大寶藏，在中國用于治療疾病的歷史已有數(shù)千年。中藥來源于植物、動物、礦物三大類。動物藥是中國醫(yī)藥寶庫中重要的組成部分，具有悠久的應(yīng)用歷史。《中國藥典》2005年版一部共收載藥材553種，其中動物藥53種，占9.6％，占可供藥用動物資源的3.2％。我國利用蛇類的歷史源遠流長，可追溯至春秋戰(zhàn)國時期。蛇類主要的利用方式為藥用、食用和制革等。常見的藥用種類有滑鼠蛇Ptyas mucosus、烏梢蛇Zaocys dhumnades

2、、銀環(huán)蛇Bungarus multicinctus、尖吻蝮Deinagkistrodon acutus等，食用的主要有灰鼠蛇Ptyas korros、滑鼠蛇、舟山眼鏡蛇Naja atra等，用于制革的有王錦蛇Elaphecarinata等。而烏梢蛇、銀環(huán)蛇和尖吻蝮蛇分別是藥典收載的生藥烏梢蛇、金錢白花蛇、蘄蛇的原動物，具有祛風(fēng)、通絡(luò)、止痙之功效，臨床應(yīng)用比較普遍。
　　 近年來，蛇的藥用價值和經(jīng)濟價值明顯提高，社會需求持續(xù)上升。

3、隨著蛇類野生資源逐漸匱乏，加上價格昂貴，藥材市場上出現(xiàn)偽品及混淆品的數(shù)量甚多，質(zhì)量問題嚴(yán)重，僅根據(jù)外部形態(tài)特征很難進行準(zhǔn)確地鑒別。此外由于蛇類本身繁殖能力不強，加之生態(tài)環(huán)境易遭破壞，偷獵、走私與濫用導(dǎo)致多種蛇類特別是瀕危蛇類的生存受到威脅。對蛇的準(zhǔn)確鑒定，不僅能準(zhǔn)確的鑒別藥材正品來源與混偽品，保證用藥的安全有效，也是加強蛇類資源保護與管理的首要環(huán)節(jié)。因此，建立快速、準(zhǔn)確的鑒定方法具有重要意義。
　　 蛇類藥材的混淆品屢見不鮮，鑒

4、別方法也不斷發(fā)展，除了傳統(tǒng)的四大鑒別方法（基源鑒別、性狀鑒別、顯微鑒別和理化鑒別），許多新的鑒別技術(shù)和先進儀器被引入蛇類藥材的鑒別之中。DNA條形碼(DNA barcoding)技術(shù)是分子鑒定的最新發(fā)展，近年來在物種鑒定方面得到了迅速的發(fā)展和應(yīng)用。DNA條形碼技術(shù)簡便高效，操作流程簡單，而且不受樣品的形態(tài)性狀以及研究者的專業(yè)水平限制，尤其適用于來源于生物體部分組織或器官的中藥材的真?zhèn)舞b定。中藥DNA條形碼分子鑒定在近幾年得到快速發(fā)展，加

5、快了中藥鑒定標(biāo)準(zhǔn)化的進程。目前，動物DNA條形碼技術(shù)最常用的基因片段是COI基因。國內(nèi)已有用基于COI片段的DNA條形碼對動物藥鱉甲、鹿茸的鑒別應(yīng)用進行了探索，均表明了其有效性。因此，收集了國內(nèi)常見藥用蛇類，探討應(yīng)用COI條形碼對蛇類識別鑒定的可行性，并分析物種間的親緣關(guān)系。
　　 一.華南地區(qū)常見藥用蛇類的DNA條形碼研究
　　 1.目的:本文擬收集華南地區(qū)常見藥用蛇類20余種，建立華南地區(qū)常見藥用蛇類的DNA條形碼數(shù)

6、據(jù)庫，用于生藥樣品鑒定并分析物種間的親緣關(guān)系。
　　 2.方法
　　 2.1標(biāo)本采集從廣東、廣西、湖南等地采集和收集蛇類物種共3科23種蛇44個樣品。經(jīng)華南瀕危動物研究所張亮鑒定，所有蛇類標(biāo)本均固定保存在95％酒精中，組織置于-20°冰箱保存。本研究結(jié)合實驗樣本及GenBank數(shù)據(jù)進行分析。
　　 2.2引物設(shè)計采用引物設(shè)計軟件Primer Premier5，設(shè)計對蛇類物種COI序列能有效擴增的引物。
　　

7、 2.3 DNA的提取及COI序列擴增
　　 1)采用動物基因組提取試劑盒對采集的動物標(biāo)本提取總DNA，用1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測模板質(zhì)量;
　　 2)對所提取的DNA的COI序列進行擴增，引物采用自行設(shè)計的雙引物擴增。引物序列為:
　　 DK1-CO1:5-‘CAACTAACCACAAAGACATCGG’-3;
　　 DK1-CO2:5-‘CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA'-3.

8、　　 反應(yīng)體系25μl:包括模板DNA、正反引物（20umol/l）各1μl，mix酶12.5μl，雙蒸水9.5μl。
　　 擴增程序:93℃預(yù)變性5min，53℃2min，循環(huán)35次，依次為93℃變性30s，53℃退火45s，70℃延伸45s，最后在70℃延伸補齊5min。
　　 2.4 PCR擴增產(chǎn)物回收純化及測序PCR產(chǎn)物用1.2％瓊脂糖電泳檢測后，置于紫外燈下進行呈像，然后用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Axygen)

9、回收。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，由上海英俊工程有限公司測序，各樣品均采用正向和反向雙向測序。
　　 2.5序列比對及分析利用BioEdit and Clustal X等軟件對測序所得序列進行排序比對并輔以手工校正，獲得長度為658bp的樣品序列，在GenBank中進行相似性檢索。排序后的序列使用MEGA5.0分子進化遺傳分析軟件，采用K-2p(Kimura2-parameter)計算遺傳距離，用鄰接法(neighbor joining

10、 method)構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹，系統(tǒng)樹各分支的置信度用自舉檢驗法(bootstrap test)，檢驗各分支的支持率，共進行1000次循環(huán)。
　　 3.結(jié)果
　　 3.1堿基組成與變異位點結(jié)果顯示，51條蛇類編碼的658個排列位點中，變異位點277個，A、T、C、G堿基平均含量分別為26.7％、28.1％、29.1％、16.1％。其中A+T含量(54.8％)明顯高于G+C含量(45.2％)。
　　 3.2物種遺傳

11、距離分析種內(nèi)遺傳距離值范圍為0-0.0409，最大的種內(nèi)遺傳距離值出現(xiàn)在烏梢蛇，其次是黃鏈蛇，為0.0377。種間遺傳距離值范圍為0.0850-0.2568。種間差異凈值的最小值出現(xiàn)在東川白環(huán)蛇與黑背白環(huán)蛇之間，為8.5％，最大值出現(xiàn)在舟山眼鏡蛇與三索錦蛇之間，達到了25.68％。最小種間遺傳距離為0.0850，種間平均遺傳距離為0.1943。
　　 銀環(huán)蛇的種內(nèi)遺傳距離最大值為0.0185，烏梢蛇為0.0409，尖吻蝮蛇為0.

12、0232。銀環(huán)蛇與其余物種的種間遺傳距離值范圍為0.1797-0.2488，烏梢蛇為0.1581-0.2375，尖吻蝮蛇為0.1528-0.2488。其種間距離最小值均遠遠大于其種內(nèi)遺傳距離最大值。
　　 3.3系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建基于COI序列，通過鄰接法(NJ)所構(gòu)建的系統(tǒng)聚類樹圖可以看出同屬序列聚在一起，同種個體的聚集趨勢十分顯著，相同物種相應(yīng)分支的支持值均為100。所研究的3個科51個個體分成3個支系。游蛇科Colubrid

13、ae的31個個體構(gòu)成了第一個支系，后與第二支系眼鏡蛇科Elapidae聚類;第二支系眼鏡蛇科由舟山眼鏡蛇，銀環(huán)蛇與眼鏡王蛇3種蛇構(gòu)建，自舉檢驗置信度為77;第三支系為蝰科Viperinae6種蛇，自舉檢驗置信度為98。
　　 4.結(jié)論
　　 4.1本文采用自行設(shè)計的引物擴增蛇類各物種，均得到了100％的擴增效率與測序效率。
　　 4.2 COI作為DNA條形碼對文中20余種常見藥用蛇類具有較好的鑒別能力，并精確至

14、物種的劃分。
　　 4.3本研究為蛇類物種間親緣關(guān)系提供了新的參考信息，利用DNA條形碼技術(shù)能對物種進行分類、鑒別，為物種保護提供了重要的技術(shù)手段。
　　 二.金錢白花蛇及常見混偽品的DNA條形碼鑒定
　　 1.目的:本文擬收集了金錢白花蛇及其常見混偽品，擴增其COI序列，利用DNA條形碼技術(shù)對金錢白花蛇及其混偽品進行鑒別研究。
　　 2.方法
　　 2.1標(biāo)本采集收集和采集金錢白花蛇及其常見混偽

15、品共9種蛇的原動物標(biāo)本39份，經(jīng)鑒定后，置95％酒精中，保存于標(biāo)本館;從市場上購買金錢白花蛇生藥10份。
　　 2.2 DNA的提取及COI序列擴增、PCR擴增產(chǎn)物回收純化及測序、序列比對及分析。方法同“華南地區(qū)常見藥用蛇類DNA條形碼研究”所述。對所提取的DNA的COI序列進行擴增，引物采用LCO1490和HCO2198雙引物擴增，引物序列分別為:LCO1490:5‘-GGT CAA CAAATC ATAAAG ATA TTG

16、 G'-3,HCO2198:5‘-TAAACT TCA GGG TGA CCAAAAAAT CA'-3。
　　 3.結(jié)果
　　 3.1堿基組成與變異位點銀環(huán)蛇與其主要混偽品的COI序列存在較多變異位點，有255個變異位點，403個保守位點;A、T、C、G堿基平均含量分別為26.5％、29.2％、28.6％、15.8％; GC含量范圍為40.1％-47.4％，平均GC含量為44.3％。各物種種內(nèi)GC含量變化較小，15條銀環(huán)

17、蛇中有10條GC含量均為43.3％，2條為43.2％，2條為42.9％;4條赤鏈蛇中2條GC含量為46.8％，另外2條分別為46.4％和47.0％;4條鉛色水蛇中2條GC含量為44.5％，另外兩條分別為44.7％和44.8％;4條黃斑漁游蛇Xenochrophis flavipunctatus中2條GC含量為44.1，另兩條為44.2％;其余各物種種內(nèi)GC含量均相等，金環(huán)蛇B.fasciatus2條均為40.1％，尖吻蝮蛇3條均為46.

18、0％，赤鏈華游蛇Sinonatrix annularis2條均為45.9％，舟山眼鏡蛇3條均為47.4％，百花錦蛇E.moellendorffi2條均為42.6％。
　　 3.2種內(nèi)變異銀環(huán)蛇的15條種內(nèi)序列，主要變異位點有14處，其轉(zhuǎn)換/顛換值為6;轉(zhuǎn)換總數(shù)為12，在5、214、268、298、318、500、622的位置進行T-C轉(zhuǎn)換，在181、184、499、517、628的位置進行A-G轉(zhuǎn)換;顛換總數(shù)為2，分別在217的

19、位置G-C顛換，562的位置A-T顛換。銀環(huán)蛇種內(nèi)平均K2P距離為0.0103，種內(nèi)最大K2P為0.0201，種內(nèi)COI序列變異較小。
　　 赤鏈蛇的種內(nèi)K2P距離范圍為0.0030-0.0361，平均種內(nèi)K2P距離為0.0195;鉛色水蛇種內(nèi)K2P距離范圍為0.0015-0.0030，平均值為0.0023;黃斑漁游蛇的種內(nèi)K2P距離為0-0.0015，平均值為0.0010;舟山眼鏡蛇、尖吻蝮蛇、金環(huán)蛇、百花錦蛇和赤鏈華游蛇的種

20、內(nèi)K2P距離值均為0。
　　 3.3種間變異種間平均K2P距離為0.2178，最小種間平均K2P距離值出現(xiàn)在金環(huán)蛇與銀環(huán)蛇之間為0.1557，遠大于Hebert所推薦的物種鑒定最小種間遺傳距離0.027;最大種間變異為0.2578，出現(xiàn)在金環(huán)蛇與尖吻蝮蛇之間。銀環(huán)蛇與金環(huán)蛇的種間遺傳距離最小，與尖吻蝮蛇的種間遺傳距離最大。
　　 3.4金錢白花蛇及其混偽品的NJ樹基于9種蛇的39個COI序列，通過鄰接法(NJ)所構(gòu)建的系

21、統(tǒng)聚類樹圖同屬序列聚在一起，且各物種又形成相對獨立的枝，其支持率均為100。從基于COI序列的NJ樹中明顯地看到，銀環(huán)蛇與其混偽品能夠很好地區(qū)分開。
　　 3.5動物飲片序列比對及檢索結(jié)果從廣東市場上收集金錢白花蛇藥材10份，獲得其COI條形碼，在BOLD系統(tǒng)中進行檢索，利用BOLD系統(tǒng)中的鑒定引擎，能迅速準(zhǔn)確地鑒定出金錢白花蛇的真?zhèn)?，并確認(rèn)其物種信息，物種相似度達到99.08％-100％。
　　 4.結(jié)論