莪術(shù)組植物的DNA條形碼鑒定及藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究.pdf

1、莪術(shù)（CURCUMAE RHIZOMA）為姜科植物蓬莪術(shù)Curcuma phaeocaulis Val、廣西莪術(shù)Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang或溫郁金 Curcuma wenyujinY.H.Chen et C.Ling的干燥根莖。后者習(xí)稱“溫莪術(shù)”。莪術(shù)為常用中藥，國(guó)內(nèi)需求量較大，同時(shí)大量出口東南亞、日本、美國(guó)等地。本文綜合應(yīng)用了傳統(tǒng)鑒定方法和DNA條形碼技術(shù)相結(jié)合的手段對(duì)三種不同來(lái)

2、源的莪術(shù)進(jìn)行研究，并對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，從而為莪術(shù)的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。
　　目的：
　　莪術(shù)作為多來(lái)源的藥材，臨床使用十分混亂。其不同來(lái)源藥材的外觀性狀相近，就連一些專家學(xué)者都難以分辨，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)其分種問(wèn)題也一直存在著爭(zhēng)議。鑒于莪術(shù)市場(chǎng)存在的來(lái)源不明等情況比較嚴(yán)重，有必要建立基于DNA條形碼的莪術(shù)鑒別體系，對(duì)傳統(tǒng)鑒定加以補(bǔ)充。對(duì)不同來(lái)源的莪術(shù)進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控，明確不同來(lái)源莪術(shù)的化學(xué)成分差異，以更好地指導(dǎo)莪術(shù)的臨床應(yīng)用。

3、　　方法：
　　1.傳統(tǒng)的基原鑒定及性狀鑒定：參照《中國(guó)植物志》、《中國(guó)藥典》，結(jié)合藥材的性狀鑒定，根據(jù)專家鑒定結(jié)果，初步判斷來(lái)源。
　　2.DNA條形碼鑒定：采用CTAB法、試劑盒法提取基因組總DNA，以ITS2，psbA-trnH做為通用引物，運(yùn)用2*PCR MIX試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后得到序列，通過(guò)Codon Code Aligner4.2.5、Mega6.05等軟件對(duì)測(cè)序后的序列進(jìn)行系統(tǒng)分析，考察不同種之

4、間的親緣關(guān)系，建立莪術(shù)組植物的分子鑒定方法。
　　3.常規(guī)檢查：根據(jù)《中國(guó)藥典》（2010年版一部）莪術(shù)項(xiàng)下對(duì)所收集樣品進(jìn)行常規(guī)項(xiàng)檢查，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)及依據(jù)。
　　4.氣相色譜分析：運(yùn)用GC測(cè)定法，參考文獻(xiàn)，并加以改進(jìn)，建立了莪術(shù)GC指紋圖譜的研究方法。繪制其指紋圖譜，進(jìn)行比對(duì)、研究；并運(yùn)用聚類分析統(tǒng)計(jì)方法對(duì)結(jié)果加以討論。
　　結(jié)果：
　　1.傳統(tǒng)的基原鑒定及性狀鑒定：經(jīng)專家鑒定莪術(shù)樣品分別為蓬莪術(shù)

5、、廣西莪術(shù)、溫郁金的原植物及干燥根莖，確定了其基原。
　　2.DNA條形碼鑒定：CTAB法和試劑盒法均能從莪術(shù)中提取到足夠量的基因組DNA用于PCR的擴(kuò)增，ITS2、psbA-trnH引物擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)測(cè)序，結(jié)果表明ITS2基因間隔區(qū)序列存在大量簡(jiǎn)單重復(fù)序列，造成結(jié)合、雜合問(wèn)題，因此選用psbA-trnH序列進(jìn)行莪術(shù)鑒定，并建立了莪術(shù)系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)。
　　3.常規(guī)檢查：對(duì)莪術(shù)進(jìn)行檢查，結(jié)果表明灰分測(cè)定及浸出物測(cè)定項(xiàng)均符合規(guī)定，

6、而水分測(cè)定項(xiàng)及揮發(fā)油測(cè)定項(xiàng)有部分樣品不符合規(guī)定。
　　4.氣相色譜分析：用建立的色譜條件，測(cè)定得到的莪術(shù)GC圖譜，共有15個(gè)共有峰，其中指認(rèn)了4個(gè)色譜峰。共有峰的相對(duì)峰面積RSD均小于3％，12批的莪術(shù)指紋圖譜相似度為0.478-0.912；聚類分析結(jié)果較好，能將不同產(chǎn)區(qū)的莪術(shù)聚在一起。
　　結(jié)論：
　　1.傳統(tǒng)的基原鑒定及性狀鑒定：傳統(tǒng)的鑒定較為困難，需經(jīng)專業(yè)人士的綜合判斷方能確定其基原。
　　2.DNA條形碼