中草藥DNA條形碼分子鑒定：從基因到基因組.pdf

1、鑒定中藥的“真?zhèn)蝺?yōu)劣”是確保中藥質(zhì)量的關(guān)鍵所在，而其中“真?zhèn)巍备侵兴幣R床用藥安全的重要前提，特別是針對貴重藥材以及有毒中藥而言。DNA條形碼作為一項(xiàng)快速準(zhǔn)確鑒定物種的方法在藥用植物基原以及藥材鑒定中的應(yīng)用已非常廣泛。通過構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)的DNA條形碼參考數(shù)據(jù)庫是該技術(shù)應(yīng)用的主要形式。盡管不同學(xué)者提出了諸多用于植物鑒定的DNA條形碼，但由于片段長度的限制，單一序列或多序列組合的條形碼在近緣種之間的鑒定仍有很大的局限性。植物葉綠體基因組作為用于篩

2、選DNA條形碼序列的研究熱點(diǎn)，其本身也可作為超級條形碼(Superbarcode)用于系統(tǒng)進(jìn)化、親緣關(guān)系以及物種鑒定研究。本研究圍繞DNA條形碼鑒定技術(shù)，首先以《日本藥局方》（以下簡稱“藥局方”）中收載的生藥材為對象，構(gòu)建了藥局方生藥DNA條形碼分子鑒定系統(tǒng);其次，選取人參屬藥用植物作為名貴藥材代表、烏頭屬藥用植物作為有毒中藥代表，分別對該技術(shù)在這兩個(gè)屬中的應(yīng)用進(jìn)行了研究;最后，利用高通量測序技術(shù)測定了烏頭屬葉綠體基因組，為葉綠體基因組

3、作為超級條形碼奠定基礎(chǔ)，為篩選適合該屬的高變異分子標(biāo)記提供依據(jù)。本研究主要內(nèi)容及結(jié)論如下:
　　1、建立了一套以ITS2序列為主psbA-trnH序列為輔的漢方生藥材標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼數(shù)據(jù)鑒定系統(tǒng)。該系統(tǒng)為用戶提供了漢方草藥信息查詢、DNA條形碼物種鑒定以及從樣品采集到數(shù)據(jù)分析的標(biāo)準(zhǔn)操作流程三項(xiàng)主要功能。共搜集來自日本及中國不同地區(qū)的基原植物和生藥材樣本共計(jì)576份，從中獲取的標(biāo)準(zhǔn)序列覆蓋了97.3％的藥局方（十六版）收載生藥品種。

4、另外搜集了100份待測樣本，用來檢驗(yàn)數(shù)據(jù)庫的鑒定效果。通過BLAST結(jié)果顯示，100份樣品中有71份樣品獲得的結(jié)果與標(biāo)簽上所標(biāo)注的物種一致，即準(zhǔn)確鑒定到物種水平。其余29份樣品鑒定到屬水平。本課題建立了全世界首個(gè)國家級藥品法典的DNA條形碼分子鑒定在線平臺，為全世界其它如中、美、韓等國家的藥典提供示范作用。
　　2、采用ITS2序列對人參屬藥用植物的SNP位點(diǎn)（single nucleotide polymorphism）進(jìn)行研究

5、，發(fā)現(xiàn)五個(gè)穩(wěn)定的可作為獨(dú)特標(biāo)記用來區(qū)分人參屬不同物種以及人參西洋參混合粉末的種間變異位點(diǎn)。同時(shí)，針對人參屬ITS2序列的基因組多拷貝進(jìn)行變異分析，發(fā)現(xiàn)ITS2序列在基因組內(nèi)變異較小時(shí)，其在該種的種內(nèi)變異也較小，反之亦然。再者，使用三個(gè)常用DNA條形碼(ITS2、psbA-trnH和matK)，共計(jì)377條序列，對人參屬藥用植物的種內(nèi)變異情況進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)這三條序列在人參、西洋參和三七中的變異較低，呈現(xiàn)出高度保守的趨勢，而在竹節(jié)參中的變

6、異相對較大。本課題首次借助SNP位點(diǎn)鑒定人參、西洋參混合粉末，實(shí)現(xiàn)了基于DNA條形碼方法的人參屬珍稀瀕危物種及名貴藥材的快速準(zhǔn)確鑒定。
　　3、對烏頭屬19個(gè)物種的52份樣品的ITS、ITS2、psbA-trnH以及matK序列進(jìn)行擴(kuò)增和測序，比較候選序列的擴(kuò)增及測序成功率、種內(nèi)種間遺傳距離、barcodinggap分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹用以評估它們在烏頭屬物種中的鑒定能力。結(jié)果顯示，ITS和ITS2序列在擴(kuò)增及測序成功率上表現(xiàn)最優(yōu)

7、，均為100％。psbA-trnH序列次之，matK由于長度較長且含有poly結(jié)構(gòu)，致其擴(kuò)增和測序成功率較低。除此以外，ITS及ITS2序列在遺傳距離、barcoding gap分析上都較其余兩個(gè)候選序列有明顯優(yōu)勢。通過BLAST方法顯示ITS序列在該屬的鑒定成功率最高(57.9％)，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹也顯示基于ITS序列的烏頭屬物種呈現(xiàn)的單系性比例最高(57.9％)。綜合上述結(jié)果，針對本研究所涉及的烏頭屬物種，ITS序列的表現(xiàn)最為突出，

8、更適合用于該屬物種的鑒定。
　　4、利用高通量測序技術(shù)測定了烏頭屬北烏頭(Aconitum kusnezoffii)、牛扁(Aconitum barbatum var.puberulum)以及露蕊烏頭(Aconitum gymnandrum)的葉綠體基因組，共含有130個(gè)獨(dú)特的基因，其中包含84個(gè)蛋白編碼基因，38個(gè)tRNA和8個(gè)rRNA。通過對它們的比較分析發(fā)現(xiàn)大單拷貝區(qū)和小單拷貝區(qū)的變異大于兩個(gè)反向重復(fù)區(qū)。本研究首次測定了植物

9、界中毛茛科烏頭屬的葉綠體基因組，為其在烏頭屬系統(tǒng)進(jìn)化以及物種鑒定等領(lǐng)域的研究提供數(shù)據(jù)支持。
　　5、利用ClustalW2中的多序列比對功能對烏頭屬葉綠體基因組的基因以及基因間隔區(qū)進(jìn)行了相似度比較，并從中篩選出了十個(gè)變異程度較高的基因間隔區(qū)。將篩選出的十個(gè)高變異基因間隔區(qū)按照統(tǒng)一的順序進(jìn)行首尾連接，使其作為一條長度在6 kb左右的長片段分子標(biāo)記用于烏頭屬近緣物種鑒定。本研究利用長片段串聯(lián)序列作為烏頭屬潛在高變異分子標(biāo)記，為同屬近緣