續(xù)斷、鹿銜草、鎖陽(yáng)對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的治療作用及機(jī)理探討.pdf

1、目的
　　 以卵巢切除所致的大鼠骨質(zhì)疏松癥為模型,采用骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)方法,觀察具有溫補(bǔ)腎陽(yáng)作用的單味中藥續(xù)斷、鹿銜草以及鎖陽(yáng)對(duì)其的治療作用,并從破骨細(xì)胞分化調(diào)節(jié)因子OPG、RANKL以及與骨代謝密切相關(guān)的細(xì)胞因子IL-1、IL-6的角度,探討其作用環(huán)節(jié)及作用特點(diǎn),為中醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏松癥及“腎主骨”機(jī)理提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法
　　 本實(shí)驗(yàn)選用雌性Wistar大鼠81只,體重250±20g,SPF級(jí)。將

2、81只雌性Wistar大鼠隨機(jī)分為3組:空白對(duì)照組12只、假手術(shù)組12只和造模組57只。造模組大鼠用戊巴比妥鈉麻醉后,摘除雙側(cè)卵巢；假手術(shù)組摘取少許脂肪組織。術(shù)后1個(gè)月,再將造模組大鼠隨機(jī)分為5組:模型組12只、己烯雌酚組12只、續(xù)斷組11只、鹿銜草組11只和鎖陽(yáng)組11只。開(kāi)始灌胃給藥:中藥組灌胃給予濃度為1g生藥／ml的水煎劑,給藥體積均為5.6ml／kg體重,即給藥劑量為5.6g／kg體重；己烯雌酚組灌胃給予0.008mg／ml的己

3、烯雌酚,給藥劑量為0.0448mg／kg體重；空白對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組則灌服等體積的蒸餾水。以上各組大鼠灌胃給藥3個(gè)月,每日1次,連續(xù)灌胃給藥6天,中間休息1天。大鼠于處死前15天和前3天分別給予腹腔注射鹽酸四環(huán)素30mg／kg體重,對(duì)骨進(jìn)行熒光標(biāo)記。在灌胃給藥結(jié)束后,每組大鼠均以45mg／kg劑量的戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔注射麻醉,采用股動(dòng)脈取血,所取全血靜置1個(gè)小時(shí)后,經(jīng)2000rmp離心10min后取血清,-20℃冰凍保存?zhèn)溆?用于

4、IL-1、IL-6含量的檢測(cè)。然后,將大鼠迅速麻醉處死,取右側(cè)脛骨,用4％多聚甲醛溶液固定,制作不脫鈣骨切片,用于骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)檢測(cè)；取左側(cè)脛骨用0.1MPBS(PH7.3)配制的4％多聚甲醛溶液固定,制作脫鈣的冰凍切片用于OPG、RANKL蛋白和其mRNA表達(dá)檢測(cè)。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果皆采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s表示,以單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,組間兩兩比較,采用g檢驗(yàn)。
　　

5、 結(jié)果
　　 1續(xù)斷、鹿銜草和鎖陽(yáng)對(duì)去卵巢大鼠脛骨骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)的影響
　　 1.1續(xù)斷、鹿銜草和鎖陽(yáng)對(duì)去卵巢大鼠脛骨骨小梁體積百分比(TBV％)的影響
　　 模型組大鼠脛骨TBV％較假手術(shù)組降低。與模型組比較,續(xù)斷組、鹿銜草組和陽(yáng)性對(duì)照組的大鼠脛骨TBV％顯著增加；而鎖陽(yáng)組則無(wú)顯著性差異。續(xù)斷組、鹿銜草組和鎖陽(yáng)組大鼠脛骨TBV％較假手術(shù)組明顯降低,陽(yáng)性對(duì)照組較假手術(shù)組則無(wú)顯著性差異。見(jiàn)表1。
　　

6、 1.2續(xù)斷、鹿銜草和鎖陽(yáng)對(duì)去卵巢大鼠脛骨骨小梁吸收表面百分比(TRS％)的影響
　　 與假手術(shù)組相比,模型組大鼠脛骨TRS％明顯增加。續(xù)斷組、鹿銜草組及陽(yáng)性對(duì)照組較模型組大鼠脛骨TRS％明顯降低；鎖陽(yáng)組較模型組則無(wú)顯著性變化。續(xù)斷組、鎖陽(yáng)組與假手術(shù)組相比,顯著增高；鹿銜草組和陽(yáng)性對(duì)照組較假手術(shù)組則無(wú)顯著性差異。見(jiàn)表2。
　　 1.3續(xù)斷、鹿銜草和鎖陽(yáng)對(duì)去卵巢大鼠脛骨骨小梁形成表面百分比(TFS％)和骨小梁礦化率(MAR

7、)的影響
　　 模型組鼠脛骨TFS％和MAR明顯高于假手術(shù)組。與模型組相比,續(xù)斷組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠脛骨TFS％和MAR顯著降低,鹿銜草組、鎖陽(yáng)組則無(wú)顯著性差異。與假手術(shù)組相比,續(xù)斷組、鹿銜草組和鎖陽(yáng)組均顯著增高,陽(yáng)性對(duì)照組則無(wú)明顯差異。以上結(jié)果見(jiàn)表3。
　　 1.4續(xù)斷、鹿銜草和鎖陽(yáng)對(duì)去卵巢大鼠脛骨骨皮質(zhì)礦化率(mAR)和類(lèi)皮質(zhì)平均寬度(OSW)的影響
　　 模型組較假手術(shù)組大鼠脛骨mAR和OSW明顯升高。續(xù)斷組

8、、鹿銜草組和鎖陽(yáng)組較模型組大鼠脛骨mAR和OSW均無(wú)顯著性差異,但較假手術(shù)組均升高。陽(yáng)性對(duì)照組大鼠脛骨mAR和OSW低于模型組,與假手術(shù)組無(wú)顯著性差異。結(jié)果見(jiàn)表4。
　　 2續(xù)斷、鹿銜草和鎖陽(yáng)對(duì)去卵巢大鼠脛骨成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞OPG和RANKL表達(dá)的影響
　　 2.1續(xù)斷、鹿銜草和鎖陽(yáng)對(duì)去卵巢大鼠脛骨成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞OPG蛋白表達(dá)的影響
　　 與假手術(shù)組相比,模型組大鼠脛骨成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞OPG蛋

9、白表達(dá)均明顯降低。與模型組相比,鹿銜草組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠脛骨成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞OPG蛋白表達(dá)明顯增高；續(xù)斷組、鎖陽(yáng)組大鼠脛骨成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞OPG蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異。續(xù)斷組、鎖陽(yáng)組較假手術(shù)組大鼠脛骨成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞OPG蛋白表達(dá)明顯降低；鹿銜草組和陽(yáng)性對(duì)照組與假手術(shù)組相比,無(wú)顯著性差異。以上結(jié)果見(jiàn)表5。
　　 2.2續(xù)斷、鹿銜草和鎖陽(yáng)對(duì)去卵巢大鼠脛骨成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞RANKL蛋白表達(dá)的影響
　　 模

10、型組大鼠脛骨成骨細(xì)胞RANKL蛋白表達(dá)明顯高于假手術(shù)組。續(xù)斷組、鹿銜草組以及陽(yáng)性對(duì)照組大鼠脛骨成骨細(xì)胞RANKL蛋白表達(dá)較模型組顯著下調(diào),鎖陽(yáng)組無(wú)顯著性變化。與假手術(shù)組相比,續(xù)斷組與鎖陽(yáng)組大鼠脛骨成骨細(xì)胞RANKL蛋白表達(dá)顯著上調(diào)；鹿銜草組和陽(yáng)性對(duì)照組則無(wú)明顯差異。
　　 模型組大鼠脛骨骨髓基質(zhì)細(xì)胞RANKL蛋白表達(dá)高于假手術(shù)組。與模型組比較,續(xù)斷組、鹿銜草組以及陽(yáng)性對(duì)照組大鼠脛骨骨髓基質(zhì)細(xì)胞RANKL蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)；鎖陽(yáng)組

11、與模型組相比,無(wú)顯著差異。續(xù)斷組、鹿銜草和鎖陽(yáng)組大鼠脛骨骨髓基質(zhì)細(xì)胞RANKL蛋白表達(dá)均高于假手術(shù)組,而陽(yáng)性對(duì)照組與假手術(shù)組則無(wú)明顯差異。以上結(jié)果見(jiàn)表6。
　　 2.3續(xù)斷、鹿銜草和鎖陽(yáng)對(duì)去卵巢大鼠脛骨成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞OPGmRNA表達(dá)的影響
　　 與假手術(shù)組相比,模型組大鼠脛骨成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞OPGmRNA表達(dá)均明顯下調(diào)。與模型組相比,鹿銜草組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠脛骨成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞OPGmRNA表達(dá)明顯

12、上調(diào)；續(xù)斷組、鎖陽(yáng)組大鼠脛骨成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞OPGmRNA表達(dá)無(wú)顯著差異。續(xù)斷組、鎖陽(yáng)組較假手術(shù)組大鼠脛骨成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞OPGmRNA表達(dá)顯著下調(diào)；鹿銜草組和陽(yáng)性對(duì)照組與假手術(shù)組相比,無(wú)顯著性差異。以上結(jié)果見(jiàn)表7。
　　 2.4續(xù)斷、鹿銜草和鎖陽(yáng)對(duì)去卵巢大鼠脛骨成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞RANKLmRNA表達(dá)的影響
　　 模型組大鼠脛骨成骨細(xì)胞RANKLmRNA表達(dá)明顯高于假手術(shù)組。續(xù)斷組、鹿銜草以及陽(yáng)性對(duì)照組

13、大鼠脛骨成骨細(xì)胞RANKLmRNA表達(dá)較模型組明顯降低,鎖陽(yáng)組則無(wú)明顯差異。與假手術(shù)組相比,續(xù)斷組、鹿銜草、鎖陽(yáng)組以及陽(yáng)性對(duì)照組均無(wú)顯著性差異。
　　 模型組大鼠脛骨骨髓基質(zhì)細(xì)胞RANKLmRNA表達(dá)高于假手術(shù)組。與模型組比較,續(xù)斷組、鹿銜草組以及陽(yáng)性對(duì)照組大鼠脛骨骨髓基質(zhì)細(xì)胞RANKLmRNA表達(dá)均明顯下調(diào);鎖陽(yáng)組則無(wú)顯著差異。續(xù)斷組和鎖陽(yáng)組大鼠脛骨骨髓基質(zhì)細(xì)胞RANKLmRNA表達(dá)均高于假手術(shù)組,而鹿銜草組、陽(yáng)性對(duì)照組與假手

14、術(shù)組則無(wú)明顯差異。以上結(jié)果見(jiàn)表8。
　　 3續(xù)斷、鹿銜草和鎖陽(yáng)對(duì)去卵巢大鼠外周血血清中IL-1和IL-6含量的影響
　　 與假手術(shù)組相比,模型組大鼠外周血血清中IL-1、IL-6的含量顯著增高。與模型組相比,鹿銜草組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠外周血血清中IL-1、IL-6的含量顯著降低,續(xù)斷組IL-6的含量亦明顯降低；鎖陽(yáng)組大鼠外周血血清中IL-1、IL-6的含量無(wú)顯著差異。續(xù)斷組、鎖陽(yáng)組較假手術(shù)組大鼠外周血血清中IL-1、IL-

15、6的含量均顯著增高,鹿銜草組的IL-6含量亦明顯增高；鹿銜草組的IL-1的含量及陽(yáng)性對(duì)照組的IL-1、IL-6含量與假手術(shù)組相比,均無(wú)顯著性差異。以上結(jié)果見(jiàn)表9。
　　 與空白對(duì)照組相比,假手術(shù)組的上述指標(biāo)均無(wú)顯著性差異,從而排除了手術(shù)本身對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。
　　 結(jié)論
　　 (1)續(xù)斷、鹿銜草對(duì)卵巢切除所造成的高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松癥具有一定的治療作用,而鎖陽(yáng)則無(wú)明顯的作用。
　　 (2)鹿銜草的作用環(huán)節(jié)是,其不