水楊酸、膜醭畢赤酵母、殼寡糖誘導(dǎo)柑橘果實(shí)抗病性及其生物學(xué)機(jī)制研究.pdf

1、柑橘果實(shí)從采收到消費(fèi)需要經(jīng)歷采后處理、貯藏、運(yùn)輸和銷售等環(huán)節(jié)。在這個(gè)過程中，柑橘果實(shí)容易受到一系列生物和非生物脅迫，這些脅迫能引起果實(shí)自身生理生化的變化，并最終導(dǎo)致果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)下降，營養(yǎng)物質(zhì)損失，失水及腐爛變質(zhì)。以青霉病、綠霉病和酸腐病為代表的侵染性病害是造成柑橘采后損失的主要原因。這些病害常常發(fā)生在采后果實(shí)抗性較弱的時(shí)候，并且多數(shù)病原菌能通過果實(shí)表皮的傷口、皮孔或破壞果皮組織的角質(zhì)層侵入果實(shí)內(nèi)部。目前，對柑橘采后侵染性病害的控制主要依

2、賴于化學(xué)殺菌劑的使用，如抑霉唑，噻菌靈，嘧霉胺，咪鮮胺和咯菌腈等。然而，化學(xué)殺菌劑存在增強(qiáng)病原菌耐藥性以及危害環(huán)境和人體健康等問題，所以人們一直尋找能夠代替化學(xué)殺菌劑的病害控制技術(shù)。利用生物的、化學(xué)的和物理的激發(fā)子誘導(dǎo)果實(shí)自身的抗病能力來防治采后病害，被認(rèn)為是一種安全無污染的病害防治新方法。這些激發(fā)子能誘導(dǎo)果實(shí)局部抗病性和系統(tǒng)抗病性，增強(qiáng)果實(shí)自身的非特異性抗性來抵御病原菌的侵襲。其中，水楊酸、膜醭畢赤酵母和殼寡糖作為三種典型的果實(shí)抗性激

3、發(fā)子，能誘導(dǎo)多種果實(shí)自身抗性，增強(qiáng)果實(shí)抵御采后生物脅迫的能力。因此，本論文以柑橘果實(shí)為試材，利用這三種典型的外源激發(fā)子為處理手段，探討這三種激發(fā)子對柑橘采后病害的控制效力，對比它們誘導(dǎo)柑橘果實(shí)抗性能力的強(qiáng)弱。在此基礎(chǔ)上，借助轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，結(jié)合傳統(tǒng)生理生化分析方法，全面而系統(tǒng)的分析水楊酸、膜醭畢赤酵母和殼寡糖處理對柑橘果實(shí)基因表達(dá)、蛋白表達(dá)和物質(zhì)代謝的影響，以此探討激發(fā)子處理后柑橘果實(shí)抗性反應(yīng)的生物學(xué)機(jī)制。
　　本研究主

4、要內(nèi)容包括：⑴在損傷接種的模式下，采用2.5 mmol·L-1水楊酸，1×108 CFU·mL-1膜醭畢赤酵母細(xì)胞懸浮液和1.5%殼寡糖處理柑橘果實(shí)，能顯著降低果實(shí)采后青霉病、綠霉病、酸腐病的發(fā)病率和病斑直徑，但三種激發(fā)子的控病能力因接種方式的不同而有所差異。在處理液與病原菌同孔接種的情況下，酵母對病害的控病能力最強(qiáng)，其次是殼寡糖，水楊酸的效果最弱；在處理液與病原菌異孔接種的情況下，酵母與殼寡糖的控病能力相當(dāng)，均強(qiáng)于水楊酸。⑵采用2.5

5、 mmol·L-1水楊酸，1×108 CFU·mL-1膜醭畢赤酵母細(xì)胞懸浮液和1.5%殼寡糖浸泡柑橘果實(shí)，能顯著降低柑橘果實(shí)貯藏期間自然發(fā)病率和病情指數(shù)，且伴隨貯藏時(shí)間的延長，三者控病能力產(chǎn)生一定差異。在果實(shí)貯藏后期，殼寡糖的效果明顯好于膜醭畢赤酵母和水楊酸，酵母和水楊酸之間沒有顯著性差異。⑶利用RNA-Seq技術(shù)，從水楊酸、膜醭畢赤酵母和殼寡糖處理的樣品中篩選出差異表達(dá)基因：水楊酸處理組2344個(gè)，酵母處理組918個(gè)，殼寡糖處理組13

6、23個(gè)。熒光定量PCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明RNA-Seq的數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。這些差異基因主要參與代謝過程，細(xì)胞過程，單組織過程和刺激的響應(yīng)等生物學(xué)過程。差異基因代謝途徑分析結(jié)果表明，三種激發(fā)子刺激了柑橘果實(shí)次級代謝通路相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。同時(shí)，對碳代謝和氨基酸代謝相關(guān)通路基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)也有顯著影響。⑷利用iTRAQ技術(shù)，從水楊酸、膜醭畢赤酵母和殼寡糖處理的樣品中篩選出差異表達(dá)蛋白：水楊酸處理組109個(gè)，酵母處理組327個(gè)，殼寡糖處理組164個(gè)。

7、這些差異蛋白主要參與代謝過程，細(xì)胞過程，單組織過程等生物學(xué)過程。代謝途徑分析結(jié)果表明，三種激發(fā)子能顯著影響柑橘果實(shí)碳代謝、次級代謝生物合成相關(guān)途徑和抗氧化相關(guān)代謝途徑；同時(shí)，酵母和殼寡糖激子還能顯著影響柑橘果實(shí)逆境相關(guān)氨基酸代謝通路蛋白的表達(dá)水平。⑸柑橘果實(shí)經(jīng)水楊酸、膜醭畢赤酵母和殼寡糖處理后，對三種處理共有差異基因和共有差異蛋白的分析結(jié)果表明，苯丙烷類生物合成途徑在三種激發(fā)子誘導(dǎo)的柑橘果實(shí)抗性反應(yīng)中具有重要作用，且三種激發(fā)子對該通路上

8、關(guān)鍵基因和關(guān)鍵蛋白表達(dá)模式的調(diào)控具有一致性。⑹利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)和氨基酸自動分析儀，分析了水楊酸、膜醭畢赤酵母和殼寡糖處理后柑橘果皮主要初生代謝物—糖、有機(jī)酸和氨基酸的含量變化規(guī)律。結(jié)果顯示，三種激發(fā)子通過提高柑橘果皮中可溶性糖和三羧酸循環(huán)中關(guān)鍵的有機(jī)酸(檸檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、蘋果酸和富馬酸)的含量，為抗病反應(yīng)提供能量和底物；通過累積滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和抗氧化相關(guān)的物質(zhì)(肌醇、脯氨酸、谷氨酸等)，來增強(qiáng)細(xì)胞組織對滲

9、透脅迫和氧化脅迫的耐受力，從而強(qiáng)化果實(shí)抗逆性；通過刺激在抗病反應(yīng)中與信號物質(zhì)和抗性物質(zhì)合成密切相關(guān)的初生代謝物(草酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸)在果皮中的累積，直接間接的作用于果實(shí)的抗性反應(yīng)。⑺利用傳統(tǒng)的生理生化分析技術(shù)結(jié)合高效液相色譜(HPLC)，分析了水楊酸、膜醭畢赤酵母和殼寡糖處理對柑橘果實(shí)苯丙烷代謝途徑的影響。結(jié)果顯示，三種激發(fā)子能顯著增強(qiáng)果皮苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羥基化酶(C4H)、4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)、

10、過氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)的活性，提高柑橘果皮中綠原酸、咖啡酸、阿魏酸和對香豆酸的含量，刺激木質(zhì)素的在果皮中的累積，進(jìn)而強(qiáng)化果實(shí)的結(jié)構(gòu)抗性和生化抗性。⑻結(jié)合轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和常規(guī)生理生化分析的研究結(jié)果，從轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平和產(chǎn)物水平，全面證實(shí)了苯丙烷代謝通路參與了柑橘果實(shí)對水楊酸、膜醭畢赤酵母和殼寡糖誘導(dǎo)的抗病性應(yīng)答過程，說明激活苯丙烷代謝途徑關(guān)鍵酶的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，誘導(dǎo)該條途徑上抗性物質(zhì)的合成是這三種激發(fā)子誘導(dǎo)柑橘果實(shí)抗病性的