IKK2dn轉(zhuǎn)染未成熟樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD4+CD25-T細(xì)胞的篩選及功能鑒定.pdf

1、目的：建立一種穩(wěn)定的大鼠骨髓源性樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)的體外培養(yǎng)方法，用IKK2dn轉(zhuǎn)染未成熟樹突狀細(xì)胞(immature dendritic cells，imDC)并負(fù)載供者抗原，用其與受者T細(xì)胞進(jìn)行體外混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mixed lymphocyte reaction，MLR)誘導(dǎo)產(chǎn)生調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(T-regulatory cells，Treg)，從Treg中篩選出高活性高純度的CD4+CD25-T細(xì)胞

2、，并對CD4+CD25-T細(xì)胞免疫功能進(jìn)行初步鑒定，為Treg在誘導(dǎo)移植免疫耐受研究領(lǐng)域奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：本實驗分為兩部分進(jìn)行：第一部分，從Lewis大鼠雙側(cè)股骨及脛骨中無菌取出骨髓細(xì)胞，采用Tris-NH4Cl裂解其紅細(xì)胞，密度梯度離心法去除大部分的粒細(xì)胞、血小板以及其前體，粘附法逐步洗脫殘余的粒細(xì)胞，獲得骨髓單個核細(xì)胞(Mononuclear cell，MNC)。用粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-

3、macrophagecolony stimulating factor，GM-CSF)和白介素-4(interleukin-4，IL-4)培養(yǎng)骨髓單個核細(xì)胞，分別收集培養(yǎng)第5、7、11、13天的細(xì)胞。用光鏡及透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometer，F(xiàn)CM)檢測細(xì)胞表型，MLR鑒定其功能。第二部分，IKK2dn轉(zhuǎn)染imDC并負(fù)載供者BN大鼠抗原，將其與受者Lewis大鼠T細(xì)胞進(jìn)行體外MLR誘導(dǎo)產(chǎn)生Treg，用免疫磁

4、珠(magnetic active cell sorting，MACS)雙陰性篩選法篩選出CD4+CD25-T細(xì)胞，用光鏡及透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，F(xiàn)CM檢測細(xì)胞純度，實驗分為兩組：①對照組：絲裂霉素C滅活的BN大鼠脾細(xì)胞刺激Lewis大鼠T細(xì)胞進(jìn)行MLR；②實驗組：絲裂霉素C滅活的BN大鼠脾細(xì)胞刺激Lewis大鼠T細(xì)胞進(jìn)行MLR，同時加入CD4+CD25-T細(xì)胞。用MTT法檢測CD4+CD25-T細(xì)胞對MLR中Lewis大鼠T細(xì)胞的免疫

5、作用。
　　 結(jié)果：1.每只大鼠雙側(cè)股骨及脛骨可獲得(3.5±0.75)×107個單個核細(xì)胞，細(xì)胞活力檢測>95％。培養(yǎng)的imDC和mDC通過光鏡及透射電鏡觀察均符合其結(jié)構(gòu)特征，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型：培養(yǎng)第7天的DC其CD80、CD86、MHC-Ⅱ的表達(dá)陽性率分別約為(39.35±1.58)％、(31.22±1.28)％和(33.34±5.55)％。培養(yǎng)第11天的DC其CD80、CD86、MHC-Ⅱ的表達(dá)陽性率分別約為(72.

6、12±5.15)％、(59.44±3.02)％和(61.35±1.56)％，第11天的表型檢測結(jié)果明顯高于第7天(P<0.05)。第7天與第11天DC的MLR吸光度值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。2.將轉(zhuǎn)染IKK2dn并負(fù)載供者BN大鼠抗原的受者Lewis大鼠imDC與受者Lewis大鼠T淋巴細(xì)胞進(jìn)行MLR誘導(dǎo)產(chǎn)生的Treg，經(jīng)MACS篩選可以獲得活性及純度均在95％以上的CD4+CD25-T細(xì)胞，MTT法檢測MLR中受者T細(xì)胞

7、的增殖反應(yīng)的吸光光度值：①對照組為0.259±0.057。②實驗組：0.064±0.016。兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(.P<0.05)。
　　 結(jié)論：1.我們建立了一種穩(wěn)定的大鼠骨髓源性DC的體外培養(yǎng)方法，用GM-CSF和IL-4培養(yǎng)大鼠骨髓源性單個核細(xì)胞5～7天，可以獲得足夠數(shù)量和純度的imDC，適宜移植免疫耐受領(lǐng)域的研究。2.轉(zhuǎn)染IKK2dn并負(fù)載抗原的imDC誘導(dǎo)產(chǎn)生的Treg，經(jīng)MACS篩選可以獲得高活性高純度的CD4+