香菇C91-3菌絲發(fā)酵液蛋白(LFP91-3)口服液抗腫瘤機(jī)制的研究.pdf

1、目的：腫瘤是威脅人類健康的重大疾病之一。香菇(Lentinus edodes(Berk) Sing)屬真菌門，擔(dān)子菌亞門，層菌綱，傘菌目，側(cè)耳科，香菇屬，又名香蕈或香椹，是名貴的食藥用菌之一，含有多種有效藥用成分。研究發(fā)現(xiàn)，香菇能提高機(jī)體的免疫力，能阻止癌細(xì)胞發(fā)生，對(duì)已誘發(fā)的癌細(xì)胞亦有抑制作用。目前香菇多糖作為一種重要的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，已廣泛應(yīng)用于腫瘤的輔助治療中。除多糖外，香菇中還含有大量蛋白質(zhì)、氨基酸和多種微量元素，但國(guó)內(nèi)外對(duì)香菇發(fā)

2、酵液及其蛋白質(zhì)的抗腫瘤機(jī)制卻鮮有報(bào)道。
　　 香菇C91-3是我課題組經(jīng)多年研究篩選的一株其發(fā)酵液具有抗腫瘤、抗細(xì)菌作用的真菌，其發(fā)酵液中除含有與子實(shí)體提取物相似的大量多糖和氨基酸成分外，還含有多種蛋白成分。發(fā)酵液具有良好的抗腫瘤、抗細(xì)菌的作用。前期研究證實(shí)，香菇C91-3菌絲發(fā)酵液蛋白LFP91.3具有體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)，體外直接殺傷腫瘤作用。本試驗(yàn)主要在前人的基礎(chǔ)上，以實(shí)驗(yàn)小鼠為給藥對(duì)象，對(duì)香菇C91-3菌絲發(fā)酵液蛋白LFP9

3、1.3口服后的抑瘤作用及相關(guān)機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　 方法：發(fā)酵液經(jīng)離心、過(guò)濾、鹽析、透析、提取蛋白后，以真空干燥機(jī)濃縮20倍后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
　　 （一）LFP91-3口服液對(duì)荷瘤小鼠生存期的影響
　　 取60只昆明小鼠，全部予S180細(xì)胞（小鼠腹水型肉瘤細(xì)胞株）腹腔荷瘤。荷瘤后隨機(jī)分為6組：蒸餾水組、環(huán)磷酰胺(CTX)組、香菇多糖(LNT)組、香菇C91-3菌絲發(fā)酵液蛋白(LFP91-3)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組。每組

4、10只，荷瘤24小時(shí)后分別予蒸餾水、CTX3mg、LNT0.5mg、LFP91.3250ug、500ug、1000ug，每次0.5ml/只，在第1、3、5、7、9、11、13、15天灌胃給藥，共計(jì)8次，分別觀察六組荷瘤小鼠的生存期，研究香菇C91-3菌絲發(fā)酵液蛋白(LFP91.3)的最適劑量。
　　 （二）LFP91-3口服液對(duì)荷瘤小鼠免疫細(xì)胞和免疫因子的影響
　　 另取20只昆明小鼠，建模方法同上，荷瘤后隨機(jī)分為2組：

5、蒸餾水組、香菇C91-3菌絲發(fā)酵液蛋白(LFP91.3)最適劑量組。每組10只，荷瘤24小時(shí)后分別予蒸餾水、LFP91.3500ug，每次0.5ml/只，給藥時(shí)間同上。于接種腫瘤細(xì)胞后第16日處死小鼠，各組小鼠分別摘除眼球取血，之后脫頸處死取脾。(1)淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)實(shí)驗(yàn)：將脾細(xì)胞放入Hanks液中剪成糊狀，200目不銹鋼細(xì)胞網(wǎng)過(guò)濾分成單個(gè)脾細(xì)胞，用Hanks液洗滌，調(diào)整濃度5×106/ml。加入96孔板，每孔200μl，每個(gè)實(shí)驗(yàn)孔再加

6、ConA(50μg/ml)20μl，對(duì)照孔R(shí)PMI-1640培養(yǎng)液20μl，各設(shè)3個(gè)復(fù)孔，于37℃，5％CO2溫箱中培養(yǎng)68小時(shí)，離心1000r/min10min，吸棄上清100μl，加MTT液10μl，培養(yǎng)4小時(shí)，加DMSO液100μ1，充分吹打使紫色結(jié)晶完全溶解后使用酶標(biāo)儀測(cè)吸光OD值。(2)荷瘤小鼠血清IL-2含量的測(cè)定：如上所述分別摘除小鼠眼球取血，制備血清，用小鼠IL-2 ELISA檢驗(yàn)試劑盒，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測(cè)法，根

7、據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品OD值繪制曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待檢標(biāo)本中IL-2的含量。(3)荷瘤小鼠血清TNF-α含量測(cè)定：方法同(2)。研究LFP91.3口服液對(duì)荷瘤小鼠的抑瘤作用及機(jī)制。
　　 結(jié)果：香菇C91-3菌絲發(fā)酵液蛋白(LFP91-3)口服液對(duì)荷瘤小鼠的影響：
　　 1．能延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存期，抑制腫瘤生長(zhǎng)。LFP91-3口服后能顯著延長(zhǎng)荷瘤小鼠生存時(shí)間，對(duì)由S180腫瘤細(xì)胞所致的腹水型荷瘤小鼠，LFP91-3Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組的存

8、活期的平均值分別為：24.80d、25.10d、25.60d，較蒸餾水組(17.80d)有顯著延長(zhǎng)(P＜0.05)。LFP91-3組在各濃度下，與LNT組(24.30d)和CTX組(24.70d)無(wú)明顯差異(P＞0.05)，且荷瘤小鼠的存活時(shí)間在適宜范圍內(nèi)隨LFP91-3濃度的增大而延長(zhǎng)，存在一定的劑量依賴關(guān)系。
　　 2．能顯著提高荷瘤小鼠的細(xì)胞免疫和體液免疫。(1)淋巴細(xì)胞增殖率：LFP91.3最適劑量組的淋巴細(xì)胞增殖率0.

9、44±0.14，顯著高于蒸餾水組淋巴細(xì)胞增殖率0.18±0.09(P＜0.01)。(2)血清IL-2和TNF-α的含量：LFP91-3最適劑量組的血清IL-2和TNF-α分別為35.05±17.29pg/ml，84.27±16.88pg/ml，與蒸餾水組血清IL-2和TNF-α分別30.5±3.58pg/ml，48.33±16.70pg/ml，有明顯增加(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：香菇C91-3菌絲發(fā)酵液蛋白(LFP91-3

10、)口服液具有較好的體內(nèi)抑瘤作用，口服后能明顯延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存期，抗腫瘤效果與臨床免疫調(diào)節(jié)藥香菇多糖和臨床抗腫瘤藥物環(huán)磷酰胺無(wú)明顯差異，且荷瘤小鼠的存活時(shí)間在適宜范圍內(nèi)隨LFP91-3濃度的增大而延長(zhǎng)，存在一定的劑量依賴關(guān)系。其作用可能是通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及增強(qiáng)機(jī)體免疫功能來(lái)完成。香菇發(fā)酵液蛋白與臨床抗腫瘤藥物相比，具有療效高、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)。因此，作為香菇中另一種重要的抗腫瘤活性物質(zhì)，香菇發(fā)酵液蛋白的抗腫瘤活性和機(jī)制