香菇C91-3菌株Latcripin-11基因的預測分析、克隆表達及活性鑒定研究.pdf

1、背景：
　　香菇（Lentinula edodes）是具有豐富營養(yǎng)價值和藥用價值的食用真菌，是全球第二大食用菌，被稱作“山珍之王”、“真菌皇后”。香菇具有獨特香氣和鮮美的味道，被我國最早開發(fā)人工栽植，是食用佳肴。我國古代醫(yī)者即對香菇著有論述，稱香菇性平味甘，能夠增進食欲、補氣益力?，F(xiàn)代醫(yī)學和營養(yǎng)學研究學者也將香菇作為藥食同源的重要食材開發(fā)研究。
　　香菇屬于擔子菌門傘菌綱傘菌目光茸菌科香菇屬。子實體較大，肉厚細密。營養(yǎng)豐富，

2、含有豐富的鈣、磷、鐵、維生素和粗纖維。蛋白含量較高，種類豐富，含有18種氨基酸和30多種酶，其中包括了人體8種必需氨基酸中的7種，能夠糾正酶缺乏癥、輔助補充氨基酸。據(jù)古籍記載，香菇益胃助食、破血治風，預防麻疹痘瘡、治療頭暈頭痛?，F(xiàn)代醫(yī)學和生物科學研究針對香菇具體成分分解研究發(fā)現(xiàn)香菇多糖具有免疫調(diào)節(jié)能力，能夠抗炎抗腫瘤；香菇麥角甾醇能夠預防佝僂??；香菇脂肪酸能夠降低人體血脂等。此外香菇提取物還在抗輻射、抗衰老、降血壓、神經(jīng)炎、肝炎、動脈硬

3、化預防治療等方面發(fā)揮積極的作用。但對于香菇中蛋白成分的功能性研究較為鮮見。
　　香菇C91-3是本課題組在1991年3月從多株香菇中篩選得到的具有抗腫瘤作用的菌株，命名為“香菇C91-3”，C代表China，即中國。通過分析香菇菌絲體發(fā)酵液成分，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中除含有氨基酸、多糖等組份外，還含有多種蛋白質(zhì)組分。發(fā)酵液經(jīng)分離后其中的蛋白質(zhì)成分具有抑制腫瘤生長的作用。為了進一步探索香菇C91-3菌絲體中功能蛋白的活性和作用機制，深入、具體

4、、準確的開展香菇蛋白的抗腫瘤研究，快速獲取有抗腫瘤功效的單一蛋白組份，本課題組從基因序列著手尋找功能蛋白，采用SOLEXA高通量測序方法獲取香菇C91-3菌絲體的基因序列。通過比對分析篩選出具有抗腫瘤功能潛力的基因開展深入研究。
　　目的：
　　（1）在SOLEXA高通量測序基礎上通過分析比對，篩選出具有AhpC/TSA家族功能域的基因序列Latcirpin-11（Lp-11），利用生物信息學在線軟件預測分析Lp-11的結(jié)構(gòu)

5、、功能和活性，評估其開發(fā)價值。
　　（2）獲取Lp-11基因序列，構(gòu)建原核表達載體誘導表達獲取目的蛋白Lp-11蛋白，復性純化。
　　（3）依據(jù)生物信息學預測分析結(jié)果對其進行生物學功能驗證。
　　方法：
　　（1）在SOLEXA高通量測序的基礎上，通過比對分析篩選出具有AhpC/TSA家族功能域的基因序列Lp-11。采用多種在線預測分析軟件，如NPS@:SOPMA secondary structure pred

6、iction、Swiss-Model、通過Pfam數(shù)據(jù)庫比對分析等對Lp-11基因序列、蛋白序列、蛋白結(jié)構(gòu)進行分析預測，分析其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，以此為基礎再通過InterPro、CBS、Bioinfo、TargetP、Propen等軟件對Lp-11蛋白活性效應、功能注解進行全面分析，評估Lp-11基因序列功能活性研究潛力。
　　（2）采用RACE方法獲取Lp-11基因片段，通過大腸桿菌表達系統(tǒng)的pET系統(tǒng)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a（+）

7、-Lp-11，轉(zhuǎn)化到E.coli.Rosetta-gami(DE3)中，IPTG誘導表達獲得包涵體蛋白，經(jīng)2M尿素洗滌、8M尿素溶解后，通過尿素梯度復性方法使蛋白重新折疊，恢復空間結(jié)構(gòu)；利用His標簽采用鎳柱親和層析方法對蛋白進行純化，獲取Lp-11蛋白并采用Weastern Blot和圓二色譜分析法進行鑒定。
　?。?）Lp-11蛋白的活性鑒定。通過標記異硫氰酸熒光素（FITC）檢測Lp-11蛋白的細胞分布情況；采用1,1-二苯

8、基-2-苦基肼基自由基（DPPH）實驗和DCFH-DA熒光染料檢測Lp-11蛋白在細胞外和細胞內(nèi)清除自由基的能力；通過檢測Lp-11蛋白作用后細胞中超氧化物歧化酶活性、谷胱甘肽還原酶活性、總抗氧化能力和過氧化氫含量判斷Lp-11蛋白的氧化還原能力；通過Cell Counting Kit-8（CCK-8）檢測Lp-11蛋白對細胞生長的調(diào)節(jié)作用；通過光鏡觀察細胞生長狀態(tài)、透射電鏡觀察細胞用藥前后亞微結(jié)構(gòu)的變化、Hoechst33258熒光染

9、色后熒光顯微鏡觀察Lp-11蛋白作用后細胞核的改變；采用Annexin V-FITC/PI染色，利用流式細胞儀分析細胞凋亡狀態(tài)；通過流式細胞術PI單染對細胞的周期改變進行分析；通過JC-1在不同電位下多聚體與單體之間的變化導致熒光變化來分析細胞在藥物作用前后線粒體膜電位變化；通過酶標儀檢測Lp-11蛋白作用前后，細胞中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的變化；采用Weastern Blot方法分析細胞中Bcl-2

10、家族蛋白含量的變化；通過ELISA法檢測細胞中和線粒體中細胞色素C的變化。
　　結(jié)果：
　?。?）生物信息學分析Lp-11蛋白結(jié)構(gòu)具有空間穩(wěn)定性，能夠進入細胞，在胞漿中分布。具有線粒體相關信號肽以及7個蛋白結(jié)合位點和一個核酸結(jié)合位點。具有類似于AhpC/TSA家族的功能域，具有脫氫還原的能力。Lp-11蛋白具有深入研究價值。
　　（2）成功獲取Lp-11基因片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a（+）-Lp-11后轉(zhuǎn)化到E.c

11、oli.Rosetta-gami(DE3)中經(jīng)IPTG誘導表達獲得包涵體蛋白，尿素洗滌溶解后梯度復性、鎳柱親和層析純化，圓二色譜分析鑒定成功獲得具有空間結(jié)構(gòu)的Lp-11蛋白。
　?。?）Lp-11蛋白能夠進入細胞，分布在胞漿中，具有提高細胞內(nèi)氧化還原酶活性和總抗氧化能力的功能，同時能夠有效清除細胞中的活性氧自由基。對多種腫瘤細胞具有抑制生長的作用，其中U937細胞的抑制生長率最高，但對正常細胞具有促進生長的作用。通過線粒體途徑誘導