產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(TGase)菌株的分離、鑒定及Tgase基因的克隆表達(dá).pdf

1、谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(Microbial Transglutaminase，簡(jiǎn)稱(chēng) TGase，EC2.3.2.13)能催化多種蛋白質(zhì)分子間和分子內(nèi)的?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，改善蛋白質(zhì)的功能特性，在食品、化妝品、制藥等工業(yè)領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。
　　 本研究從土壤中篩選出產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶TGase菌株，以期獲得有較高產(chǎn)酶能力的菌株，并克隆其編碼基因，通過(guò)分子生物學(xué)手段在大腸桿菌中大量表達(dá)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶。
　　 從土壤中篩選得到一株產(chǎn)酶的

2、菌株MEPE0134，并根據(jù)菌株形態(tài)、培養(yǎng)特征、生理生化特性以及16S rDNA序列等進(jìn)行多項(xiàng)分類(lèi)研究。發(fā)現(xiàn)該菌株具有典型的芽孢桿菌屬的形態(tài)學(xué)特征，在16s rDNA序列比較分析的基礎(chǔ)上，并綜合形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及生理生化特性，初步判定該菌株與芽孢桿菌屬中的解淀粉芽孢桿菌菌種相近。
　　 首先，研究了發(fā)酵條件通氣量，接種量，培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)液初始pH值對(duì)MEPE0134產(chǎn)酶的影響，其中通氣量，培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)液初始pH對(duì)MEPE01

3、34產(chǎn)酶都有一定影響，因此，通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件可以提高產(chǎn)酶量。
　　 其次，從產(chǎn)酶菌株MEPE0134中獲得其基因組DNA，利用PCR方法擴(kuò)增出TGase全長(zhǎng)基因(tgl)并進(jìn)行測(cè)序分析，通過(guò)比較分析MEPE0134菌株的tgl序列與芽孢桿菌屬其他tgl的序列，結(jié)果表明MEPE0134的tgl與解淀粉芽孢桿菌的 TGase相似性最高。將tgl克隆到表達(dá)載體pET-22b(+)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET22-tgl，將重組質(zhì)粒pET22

4、-tgl成功轉(zhuǎn)化E.coli BL21，在IPTG的誘導(dǎo)下成功表達(dá)重組蛋白。取誘導(dǎo)表達(dá)的菌經(jīng)超聲波破菌后離心，上清液通過(guò)金屬鰲合層析進(jìn)行分離純化，獲得的樣品在電泳中顯示為單一條帶，證明成功地獲得TGase蛋白純品。
　　 接著對(duì)TGase的部分性質(zhì)進(jìn)行了研究，通過(guò)對(duì)牛血清白蛋白(BSA)的交聯(lián)，發(fā)現(xiàn)隨著蛋白濃度的增加，被交聯(lián)的蛋白量逐漸增多，而且約12小時(shí)后絕大部分的蛋白都被交聯(lián)掉了。在溫度穩(wěn)定性方面，TGase蛋白于4℃保存一