谷氨酰胺轉胺酶基因的定點突變及其酶學性質研究.pdf

1、蛋白質-谷氨酸-γ-谷氨酰胺轉胺酶（EC2.3.2.13），即谷氨酰胺轉胺酶（簡稱TGase、TG），它能催化谷氨酰胺轉胺酶中谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基發(fā)生轉移，促使蛋白分子內部及分子間的發(fā)生交聯(lián)，可改善蛋白結構，提高物質的彈性，保持蛋白的營養(yǎng)，在食品、醫(yī)藥、化妝品等領域具有非常高的實用價值。
　　谷氨酰胺轉胺酶的來源廣泛，動物來源的TG需要Ca2+來暴露其活性區(qū)的半胱氨酸殘基位點，且獲取工藝較為復雜昂貴，相較之下，微生物來源的T

2、G（Microbial transglutaminase，簡稱MTG）來源廣泛，生產周期短，不依賴Ca2+，酶的熱穩(wěn)定性更高、催化能力更強，更適合工業(yè)生產。
　　本文是筆者對實驗室保存的一株從土壤中分離得到的吸水鏈霉菌H197菌株的TG基因序列的分析，編碼區(qū)基因大小為1257bp，編碼417個氨基酸，GC含量為61.4％，分子量約為46.6kDa，pI為7.08。根據(jù)其三維空間結構的特征，設計突變位點，將酶活中心三聯(lián)體Cys151

3、-Asp342-His361中361位His(CAC)突變成Lys(AAA)。
　　設計突變引物，以重組質粒pET-22b(+)-MTG為模板，利用重疊延伸PCR技術定點突變，構建含突變位點的突變重組質粒pET-22b(+)-MTG-M，并轉化E.coli BL21（DE3）。菌落PCR及酶切驗證后測序，結果顯示：第1090位的C突變成A，第1092位的C突變成A，即His(CAC)成功突變成Lys(AAA)。獲得兩株重組菌株，即

4、突變型pET-22b（+）-MTG-M-E.coli BL21(DE3)（命名為p-B-M-M）和野生型pET-22b（+）-MTG-E.coli BL21(DE3)（命名為p-B-M）。
　　對兩種重組菌進行IPTG誘導小量表達，測定蛋白濃度及粗酶活。突變型蛋白濃度為7.69 g/L，粗酶活力為0.437U/mL，野生型蛋白濃度為7.93 g/L，粗酶活力為0.425U/mL，兩者酶活沒有顯著性差異(T檢驗P>0.05)。表明H

5、is位點的改變并不影響 MTG蛋白的表達力和酶的催化活力。從誘導條件來看，8-12h是誘導表達的最佳時間，誘導時間過長反而不利于MTG蛋白的表達；當IPTG濃度為0.8g/L時，MTG表達量最大，過高的IPTG濃度對MTG蛋白的表達反而有著一定的抑制作用；30℃時，MTG蛋白的表達達到最大值。
　　通過鎳柱對誘導表達的蛋白進行親和層析純化，野生型菌株比活力由純化前的0.056U/mg升到3.28U/mg，突變型菌株比活力由純化前的

6、0.053U/mg變?yōu)?.38U/mg，純化倍數(shù)達到近60倍。野生型蛋白酶液可在pH5-9的范圍內保持穩(wěn)定，而突變型的穩(wěn)定只能維系在pH為6-8范圍內，兩者均在pH為7.0時酶活最穩(wěn)定；MTG酶液在20℃-40℃保溫30min時，其酶活力損失較小，而在高于50℃保溫30min會失去幾乎所有的活性，說明其熱穩(wěn)定不高，相較于野生型，突變體酶的熱穩(wěn)定性更差；除Ni+和Cu2+對酶活力有較大抑制，其它供試金屬離子對MTG酶活力抑制均較小。