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文檔簡介
1、目的:大型真菌作為藥物使用在我國已有近千年的歷史,它們普遍具有降低膽固醇、降血壓等多種藥理活性,尤其是它們的抗腫瘤作用最受人們關(guān)注。香菇[1entinusedodes(berk)sing],屬真菌門,它是世界上著名的食用真菌之一。近十年,國內(nèi)外有關(guān)學(xué)者對香菇抗腫瘤作用進行了大量研究。目前,大多研究角度為:1、香菇子實體及其提取物的相關(guān)研究。而有關(guān)香菇菌絲發(fā)酵液及其提取物的研究較少。以香菇子實體作為研究對象,子實體的生長周期大約為10個月
2、,費時費力。香菇C91-3是我課題組經(jīng)多年篩選的一株其發(fā)酵液具有抗腫瘤、抗細菌作用的真菌,此發(fā)酵液中含有的多糖和氨基酸成分與子實體相似,但其發(fā)酵周期只需要5-7天,為工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。2、香菇多糖的免疫調(diào)節(jié)機制的相關(guān)研究,有關(guān)香菇蛋白的抗腫瘤作用鮮有報道。利用蛋白質(zhì)基本性質(zhì),我課題組對香菇C91-3發(fā)酵液中的蛋白進行了初步提取并進行抗腫瘤實驗,顯示此蛋白既具有體內(nèi)抗腫瘤作用,亦具有體外直接殺傷腫瘤細胞作用。同時,我們也意識到香菇作為
3、廣泛應(yīng)用的藥用真菌,深入研究其有益蛋白組分有著重要的基礎(chǔ)及臨床應(yīng)用意義。 方法:立足于前期研究基礎(chǔ)之上,進行如下工作:利用凝膠層析技術(shù)分離香菇C91-3發(fā)酵液中提取的粗蛋白(LFP91-3)。按蛋白的分子量大小將提取蛋白分成3個組分(a、b和c),經(jīng)體外活性實驗,證實C段蛋白(LFP91-3C)是抗腫瘤作用效果最強的蛋白組分,大量提取純化進行體內(nèi)實驗。 (一)LFP91-3C對荷瘤小鼠的生存期影響的實驗取24只BALB/
4、C小鼠,分別予H22細胞(腹水型肝癌細胞株)腹腔荷瘤,荷瘤后隨機將之分為3組:生理鹽水(NS)組、環(huán)磷酰胺(CTX)組、LFP91-3C組。每組8只,荷瘤24小時后分別予以NS和CTX各0.4mg、LFP91-3C100μg每日一次,每次1ml/只,腹腔注射,連續(xù)5日。分別觀察三組腫瘤細胞荷瘤小鼠的生存期。 (二)LFP91-3C對實體瘤塊生長的影響及病理觀察取24只BALB/C小鼠,分別予H22細胞右腋皮下荷瘤。分組及其用藥劑
5、量同上,右腋皮下注射小鼠,每日一次,連續(xù)10日。于接種腫瘤細胞后第13日處死小鼠,取瘤組織稱重,并用福爾馬林溶液固定,制備病理切片。研究LFP91-3C對荷瘤小鼠的抑瘤作用及機制。 (三)LFP91-3C對荷瘤小鼠免疫細胞和免疫因子的影響建立小鼠模型、分組和給藥同組(一)。于接種腫瘤細胞第12天,各組小鼠分別摘除眼球取血,之后脫頸處死取脾。(1)NK細胞活性測定:將脾細胞放入Hanks液中剪成糊狀,200目不銹鋼細胞網(wǎng)過濾分成單
6、個脾細胞,用Hanks液洗滌,調(diào)整濃度5×106/ml。96孔板中按實驗孔、效應(yīng)細胞對照孔、靶細胞對照孔分別加入脾細胞和YAC-1細胞各100μg,各設(shè)3個復(fù)孔,置37℃、5﹪CO2培養(yǎng)箱中飽和濕度培養(yǎng)20小時,離心棄上清,各孔加MTT應(yīng)用液10μl,再繼續(xù)培養(yǎng)4小時,加入溶解液MDSO100μl,充分吹打使紫色結(jié)晶完全溶解后,在酶標儀測吸光OD值。(2)淋巴細胞增殖反應(yīng)實驗:按上述方法取脾細胞,將制備好的脾細胞,加入96孔板,每孔20
7、0μl,每個實驗孔再加ConA(50μg/ml)20μl,對照孔RPMI-1640培養(yǎng)液20μl,各設(shè)3個復(fù)孔,于37℃,5﹪CO2溫箱中培養(yǎng)68小時,離心1000r/min10min,吸棄上清100μl,加MTT液10μl,培養(yǎng)4小時,加DMSO液100μl,充分吹打使紫色結(jié)晶完全溶解后使用酶標儀測OD值。(3)荷瘤小鼠血清IL-2含量的測定:如上所述摘除小鼠眼球取血,制備血清,用小鼠IL-2ELISA檢驗試劑盒,采用雙抗體夾心酶聯(lián)免
8、疫檢測法,根據(jù)標準品OD值繪制曲線,從標準曲線上查出待檢標本中IL-2的含量。(4)荷瘤小鼠血清IFN-γ含量測定:方法同(3)。 結(jié)果:1.LFP91-3C能延長荷瘤小鼠的生存期,抑制腫瘤生長。對由H22腫瘤細胞所致的腹水型荷瘤小鼠,LFP91-3C組的存活期的平均值為:22.88天,較NS組13.25天(P<0.05)和CTX組17.63天(P<0.05)有顯著延長。 2.LFP91-3C能抑制小鼠體內(nèi)實體腫瘤生長,
9、LFP91-3C組的抑瘤率為70.32﹪,CTX組抑瘤率為24.95﹪,LFP91-3C組抑瘤效果顯著強于CTX組(P<0.05)。病理切片上可見:NS對照組腫瘤組織生長旺盛,侵犯周圍組織,腫瘤細胞排列紊亂,細胞體積較大,核增大,可見巨核、多核現(xiàn)象,核分裂像增多,局部有壞死。LFP91-3C組作用后腫瘤組織生長明顯受抑制,腫瘤組織內(nèi)部和間質(zhì)可見大量炎細胞浸潤,以淋巴細胞和中性粒細胞為主,而且可見局部有大片壞死。 3.LFP91-
10、3C能顯著提高荷瘤小鼠的細胞免疫和體液免疫。(1)NK細胞活性:LFP91-3C組的NK細胞活性89.67±3.65ng。顯著高于NS組NK細胞活性65.98±7.16ng。(2)淋巴細胞增殖率:LFP91-3C組的淋巴細胞增殖率44.40±4.30ng。顯著高于NS組淋巴細胞增殖率34.57±3.50ng。(3)荷瘤小鼠血清IL-2和IFN-γ的含量:94.59±5.40ng,51.02±4.51ng。LFP91-3C組的血清IL-2
11、和IFN-γ明顯增加,分別為127.38±3.89ng,66.44±3.66ng。 結(jié)論:本實驗對香菇C91-3發(fā)酵液中的粗蛋白探索性的利用凝膠層析技術(shù)進行了初步提取、分離和純化,按蛋白的分子量大小將提取蛋白分成3個組分(a、b和c),經(jīng)體外活性實驗,證實C段蛋白(LFP91-3C)是抗腫瘤作用效果最強的蛋白組分,并進行體內(nèi)實驗。證實LFP91-3C能明顯延長荷瘤小鼠的生存期并對實體腫瘤有明顯抑制作用,還能通過激活機體的免疫系統(tǒng)
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