C2ORF40及其小分子多肽抗腫瘤作用及機制研究.pdf

1、乳腺癌是臨床上一種常見的惡性腫瘤，且無論是在發(fā)展中國家還是發(fā)達國家都高居女性因腫瘤死亡原因的前列。在我國，自從上世紀九十年代以來，國民經(jīng)濟水平有了重大發(fā)展，老百姓的生活水平普遍有了較大提高，人民的生活方式也隨之產(chǎn)生了顯著改變，而同時乳腺癌在我國很多地區(qū)的發(fā)病率卻不斷提高。當前醫(yī)療技術(shù)和水平與以往相比有了巨大提高，但臨床上針對乳腺癌的有效治療手段依然有限:外科手術(shù)切除依然是臨床上治療乳腺癌的一項最主要的治療方案，但患者術(shù)后腫瘤轉(zhuǎn)移和復發(fā)率

2、很高;目前對乳腺癌的輔助治療方案主要包括放射治療和化學藥物治療等療法，但這些治療方案普遍對患者有不同強度的副作用，甚至對正常機體功能有嚴重影響。因此，如何能深入探究乳腺腫瘤的發(fā)生和發(fā)展的分子作用機制，研發(fā)新的早期診斷標記和開發(fā)相應的有效治療方案對臨床上乳腺癌的治療具有及其重要的價值。
　　C2ORF40(chromosome2 open reading frame40)，別名esophageal cancerrelated gen

3、e4或proaugurin，是一種高度保守的基因，其最早的研究報道見于1998年科學家對食管癌的研究，目前對其相關(guān)研究和認識還很局限。近年來研究人員發(fā)現(xiàn)，C2ORF40可能是一種候選抑癌基因，不斷有研究結(jié)果證實其在諸多細胞生物學進程中能夠發(fā)揮重要的調(diào)控作用，包括腫瘤細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等。近來研究結(jié)果表明C2ORF40轉(zhuǎn)錄水平在許多腫瘤疾病中發(fā)生了明顯下調(diào)，包括食管癌、前列腺癌、結(jié)腸癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤等，并且臨床研究證據(jù)發(fā)現(xiàn)這種轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)

4、與腫瘤病人預后有十分密切的關(guān)聯(lián)。C2ORF40被視為一種重要的抑癌基因，但目前對其在腫瘤中的蛋白表達水平及臨床意義少有研究報道。同時，細胞周期調(diào)控紊亂是惡性腫瘤的一項重要基本特征，能夠?qū)е履[瘤細胞增殖活力大大增強，且腫瘤惡性程度不斷加重。因而，對細胞周期及其相關(guān)調(diào)控基因的深入研究有助于闡明腫瘤如何發(fā)生與其發(fā)展的分子機制，并有助于發(fā)現(xiàn)針對腫瘤進行早期有效篩查和診斷的相關(guān)的分子標記物，為治療臨床上腫瘤疾病提供堅實的科研基礎(chǔ)。目前，C2ORF

5、40被廣大學術(shù)界視為一種潛在的抑癌基因及重要的治療靶點，但是其在乳腺腫瘤中的具體作用及分子機制還未明確。本課題經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌患者臨床病例組織中C2ORF40蛋白表達水平發(fā)生了顯著降低，且進一步研究發(fā)現(xiàn)C2ORF40表達水平和腫瘤中很多重要的臨床病理學特征有十分緊密的關(guān)聯(lián)。同時，研究發(fā)現(xiàn)C2ORF40基因能夠編碼148個氨基酸組成的蛋白產(chǎn)物，并且這種蛋白包含能夠被弗林蛋白酶或凝血酶所特異性識別位點，能夠經(jīng)被相應的蛋白酶剪切處理從而生成

6、多種小分子多肽。已有研究證實在某些細胞條件培養(yǎng)基中能夠檢測到這些分泌的小分子多肽，并且獲得的這種條件培養(yǎng)基上清液具有抑制細胞增殖的能力。但目前還沒有關(guān)于來源于C2ORF40基因的小分子多肽能否作用于乳腺癌的研究報道。本論文發(fā)現(xiàn)一種C2ORF40衍生物，其作為小分子多肽來源于C2ORF40基因并經(jīng)凝血酶剪切處理生成，有著明顯的抗腫瘤活性，我們通過體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，這種源于C2ORF40的衍生物能夠顯著抑制乳腺癌細胞的增殖能力、侵襲和轉(zhuǎn)移能

7、力。更重要的是，我們對于C2ORF40如何發(fā)揮抗腫瘤作用的分子機制進行了深入探宄，研究結(jié)果證明C2ORF40能夠通過調(diào)控重要的有絲分裂基因，顯著影響細胞周期進程，在有絲分裂進程產(chǎn)生障礙，以阻礙乳腺癌細胞的生長，從而發(fā)揮其抗腫瘤功能。
　　本研究課題主要探索了C2ORF40及其衍生物對乳腺癌的抗腫瘤作用，并對可能的分子機制進行了深入研究。該項研究不僅進一步闡明了C2ORF40的生物學功能，并對其分子作用機制進行了深入研究，同時為開發(fā)

8、臨床上針對乳腺癌新的診斷指標和研發(fā)新的有效治療方案提供了研究靶點。
　　第一部分 C2ORF40與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性研究
　　[目的]
　　檢測臨床上乳腺癌病人病例組織樣本中C2ORF40的表達水平，并進一步探究乳腺腫瘤病人病例組織中C2ORF40表達水平與相關(guān)臨床病理特征間的關(guān)聯(lián)，明確C2ORF40在乳腺癌中的臨床意義，同時為更全面探索C2ORF40在乳腺癌中的作用及機制奠定科學基礎(chǔ)。
　　[方法]

9、r>　　1.收集山東大學齊魯醫(yī)院乳腺外科手術(shù)切除的乳腺癌組織及其相對應對應的癌旁組織，分別經(jīng)qRT-PCR實驗測C2ORF40在乳腺腫瘤組織及相應的癌旁組織中轉(zhuǎn)錄水平，經(jīng)Western blot實驗檢測乳腺腫瘤組織及其癌旁組織中C2ORF40蛋白水平。
　　2.采用Alenabio生物科技公司的乳腺癌組織芯片(BC081116C)，應用免疫組化染色實驗來對正常乳腺組織、原位乳腺癌組以及有轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中C2ORF40蛋白表達水平

10、進行檢測，并進一步通過統(tǒng)計學方法分析C2ORF40表達水平與患者年齡、腫瘤轉(zhuǎn)移、分化程度及其TNM分期等乳腺癌病理特征之間的關(guān)聯(lián)。
　　[結(jié)果]
　　1.采用qRT-PCR實驗檢測C2ORF40在乳腺腫瘤組織及其相應的癌旁組織中轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示與乳腺腫瘤癌旁組織相比，C2ORF40轉(zhuǎn)錄水平在乳腺腫瘤組織中顯著降低。
　　2.采用Western blot實驗對C2ORF40在乳腺腫瘤組織及其相應的癌旁組織中的蛋白表達水

11、平進行檢驗，結(jié)果表明與相應的乳腺癌旁組織中C2ORF40蛋白表達水平相比，腫瘤組織中C2ORF40表達水平發(fā)生了明顯降低。
　　3.取乳腺癌組織芯片經(jīng)免疫組化染色實驗檢驗C2ORF40蛋白在正常乳腺組織、原位乳腺癌組織以及有轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中表達情況，結(jié)果表明C2ORF40蛋白于正常乳腺組織中表達水平較高，在原位腫瘤組織中C2ORF40蛋白表達水平發(fā)生明顯下調(diào)，而在發(fā)生轉(zhuǎn)移的乳腺腫瘤組織中C2ORF40蛋白水平最低。統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)

12、，C2ORF40表達水平與乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度及TNM分期等臨
　　床病理學特征緊密相關(guān)。
　　[結(jié)論]
　　1.在正常乳腺組織中C2ORF40轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平明較高，而其表達情況在腫瘤組織中則則發(fā)生了顯著下調(diào)，提示C2ORF40在乳腺腫瘤中屬于抑癌基因。
　　2.免疫組化實驗數(shù)據(jù)證實，與正常乳腺組織中C2ORF40蛋白表達情況相比，原位癌組織中C2ORFR40表達發(fā)生明顯下調(diào)，在有轉(zhuǎn)移的乳腺腫瘤組織

13、中其表達水平最低。進一步分析表明乳腺癌患者C2ORF40表達水平且與其相應腫癌臨床病理特征密切相關(guān)。
　　第二部分 C2ORF40及其衍生物抗腫瘤作用研究
　　[目的]
　　第一部分臨床病例研究表明C2ORF40在乳腺癌中表達水平降低，且與乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移、分化程度及其TNM分期等緊密相關(guān)。本部分我們通過體外實驗和體內(nèi)異種移植瘤模型深入研究C2ORF40及其衍生物抗腫瘤作用及其作用機制。
　　[方法]
　　1.

14、通過生物科技公司Synpeptide（Shanghai，China）合成C2ORF40衍生物即小分子多肽C2ORF40 mimic peptide(C2ORF40MPF)及其對照Scrambled C2ORF40mimic peptide(ScrC2ORF40)。
　　2.應用乳腺癌細胞和肺癌細胞，通過MTT實驗和克隆形成實驗檢測C2ORF40MPF多肽對腫瘤細胞增殖能力的作用。
　　3.應用乳腺癌細胞，通過Transwel

15、l遷移實驗檢測C2ORF40MPF多肽對腫瘤細胞遷移能力的作用。
　　4.應用乳腺癌細胞，采用Matrigel侵襲實驗檢測C2ORF40MPF多肽對腫瘤細胞侵襲能力的作用。
　　5.應用動物實驗，經(jīng)MDA-MB-231細胞系建立裸鼠移植瘤模型，并給予C2ORF40MPF多肽進行治療，從而通過體內(nèi)實驗進一步驗證C2ORF40MPF能否抑制乳腺腫瘤的生長。
　　6.構(gòu)建C2ORF40基因過表達質(zhì)粒（pBabe-C2ORF4

16、0），經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染pBabe-C2ORF40及其對照空白質(zhì)粒，我們前期研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌細胞系BT549和MDA-MB-231中C2ORF40表達水平較低，從而選用上述細胞系來構(gòu)建穩(wěn)定高表達C2ORF40的細胞株及其對照細胞株(BT549-pBabe，BT549-pBabe-C2ORF40，MDA-MB-231-pBabe，MDA-MB-231-pBabe-C2ORF40)。應用嘌呤霉素進行篩選，然后采用RT-PCR和Western b

17、lot方法來驗證我們所建立的細胞系中C2ORF40的mRNA水平和蛋白表達水平。
　　7.應用以上篩選獲得的穩(wěn)定過表達C2ORF40的BT549和MDA-MB-231細胞株及相應空白對照細胞，采用流式細胞術(shù)實驗來檢測C2ORF40是否調(diào)控腫瘤細胞周期。
　　8.應用C2ORF40穩(wěn)定高表達及其空白對照乳腺癌細胞株，將細胞周期同步化技術(shù)與流式細胞術(shù)方法相結(jié)合，更深入闡明C2ORF4是如何調(diào)控細胞周期。
　　9.采用乳腺癌

18、細胞系經(jīng)流式細胞術(shù)實驗檢測C2ORF40MPF多肽是否對腫瘤細胞周期有作用;并將細胞同步化技術(shù)與流式細胞術(shù)實驗相結(jié)合，從而更深入闡明C2ORF40MPF多肽細胞周期的調(diào)控作用。
　　10.應用穩(wěn)定高表達及其空白對照C2ORF40的乳腺癌細胞株，通過免疫熒光染色實驗來檢測過表達C2ORF40對有絲分裂進程的具體作用。
　　[結(jié)果]
　　1.成功構(gòu)建并合成C2ORF40衍生物C2ORF40MPF及其對照ScrC2ORF40

19、。
　　2.MTT實驗結(jié)果和克隆形成實驗結(jié)果顯示，C2ORF40MPF多肽可以顯著抑制乳腺癌細胞和肺癌細胞的增殖能力。
　　3.Transwell遷移實驗表明C2ORF40MPF多肽能夠明顯抑制腫瘤細胞遷移。
　　4.Matrigel侵襲實驗結(jié)果表明C2ORF40MPF可以明顯抑制腫瘤細胞侵襲能力。
　　5.異種移植瘤實驗證實C2ORF40MPF能夠在體內(nèi)明顯抑制乳腺腫瘤的生長。
　　6.成功構(gòu)建過表達C2

20、ORF40的質(zhì)粒(pBabe-C2ORF40)，并獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染C2ORF40的乳腺癌細胞BT549和MDA-MB-231（分別命名:BT549-pBabe，BT549-pBabe-C2ORF40; MDA-MB-231-pBabe,MDA-MB-231-pBabe-C2ORF40）。通過RT-PCR和Western blot實驗驗證以上細胞系確實得構(gòu)建成功。
　　7.應用C2ORF40穩(wěn)定高表達及其空白對照細胞株，流式細胞術(shù)實驗結(jié)

21、果表明高表達C2ORF40使細胞周期中G2/M期增多。
　　8.應用C2ORF40穩(wěn)定高表達及其空白對照乳腺癌細胞株，將細胞同步化處理與流式細胞術(shù)方法相結(jié)合，結(jié)果顯示C2ORF40誘導產(chǎn)生有絲分裂阻滯。
　　9.流式細胞術(shù)實驗結(jié)果證實C2ORF40MPF多肽能明顯增加腫瘤細胞G2/M期比例再將細胞同步化實驗與流式細胞術(shù)實驗結(jié)合進一步證實其對細胞周期阻滯作用。
　　10.應用C2ORF40穩(wěn)轉(zhuǎn)乳腺癌細胞系，免疫熒光實驗結(jié)

22、果表明C2ORF40將細胞周期阻滯在有絲分裂前中期并造成多核細胞生成增多，該項結(jié)果有力證實了C2ORF40對有絲分裂的阻滯作用。
　　[結(jié)論]
　　1.C2ORF40及其C2ORF40衍生物對細胞周期有調(diào)控作用，通過將細胞周期阻滯在有絲分裂前中期并造成多核細胞增多，干擾細胞有絲分裂過程，對腫瘤細胞生長產(chǎn)生抑制作用。
　　2.C2ORF40衍生物能夠有效抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。
　　第三部分 C2ORF

23、40調(diào)控細胞周期的分子機制研究
　　[目的]
　　以上研究表明C2ORF40在乳腺癌中具有明顯的抗腫瘤作用，且在腫瘤細胞周期進程中發(fā)揮了明顯的調(diào)控作用，但是其作用機制尚不明確，本部分我們通過一系列實驗深入探究C2ORF40抗腫瘤作用的具體分子機制。
　　[方法]
　　1.利用GEO基因表達數(shù)據(jù)庫經(jīng)過生物信息學技術(shù)分析C2ORF40可能的靶基因;應用我們建立的穩(wěn)定過表達C2ORF40的腫瘤細胞株其空白對照細胞，通過

24、qRT-PCR實驗方法驗證上述分析結(jié)果。
　　2.應用建立的過表達C2ORF40的乳腺癌細胞系及其空白對照細胞株，通過Western blot實驗方法來檢測C2ORF40對有絲分裂基因的影響。
　　3.構(gòu)建BIRC5高表達質(zhì)粒（p3xflag-cmv-10-BIRC5），在高表達C2ORF40乳腺癌細胞系中轉(zhuǎn)染BIRC5質(zhì)粒，經(jīng)RT-PCR和Western blot實驗驗證BIRC5的表達水平變化;進一步經(jīng)流式細胞術(shù)實驗驗證

25、BIRC5是否能改變C2ORF40對細胞周期的影響。
　　4.通過Alenabio生物科技公司的乳腺癌組織芯片(BC081116C)，采用免疫組化染色實驗來檢測BIRC5蛋白在正常乳腺組織、原位腫瘤組織以及有轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中表達情況的變化，并進一步經(jīng)統(tǒng)計學方法分析其表達水平與對應標本中C2ORF40表達水平之間的相關(guān)性。
　　[結(jié)果]
　　1.經(jīng)生物信息學分析發(fā)現(xiàn)C2ORF40的作用基因大部分是重要的有絲分裂相關(guān)基因

26、。
　　2.經(jīng)qRT-PCR和Western blot實驗驗證，C2ORF40能夠降低有絲分裂基因BIRC5的表達水平;流式細胞術(shù)實驗證實在乳腺癌細胞中回調(diào)BIRC5水平能夠部分逆轉(zhuǎn)C2ORF40引起的細胞周期阻滯作用。
　　3.組織芯片的免疫組化實驗數(shù)據(jù)表明，與正常乳腺組織相比，BIRC5在腫瘤組織中表達水平顯著上調(diào)，且統(tǒng)計學分析研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)C2ORF40的表達水平和BIRC5的表達水平呈明顯負相關(guān)。
　　[結(jié)論]<