松褐天牛腫腿蜂SspCSP2和SspOBP7的功能分析.pdf

1、靈敏的嗅覺系統(tǒng)在昆蟲寄主定位、尋找配偶等行為過程中起著重要的作用。目前的研究表明，氣味結(jié)合蛋白(OBPs)、化學(xué)感受蛋白(CSPs)等多種蛋白在對氣味分子的識別過程中起著重要的功能，但對于OBPs或CSPs在昆蟲中確切的生理功能及識別氣味分子的機制并不是很清晰。前期在對林業(yè)重要害蟲松褐天牛Monochamus alternatus Hope寄生性天敵松褐天牛腫腿蜂Sclerodermus sp.觸角轉(zhuǎn)錄組測序中，鑒定了多個OBPs和CS

2、Ps基因，但對于OBPs和CSPs在其嗅覺感受中功能并未深入了解。為此，本課題以松褐天牛腫腿蜂為研究對象，分析了SspCSP2的時空表達(dá)特征及與氣味分子的結(jié)合特性，探索了SspOBP7與寄主揮發(fā)物的結(jié)合特性及結(jié)合機制，以期為探明OBPs和CSPs在其嗅覺感受中的功能奠定理論基礎(chǔ)。主要的研究結(jié)果如下:
　?。ㄒ唬┧珊痔炫Ｄ[腿蜂SspCSP2的功能分析
　　1.松褐天牛腫腿蜂SspCSP2基因的克隆及時空表達(dá)特性
　　通過

3、PCR技術(shù)，克隆得到了1個CSPs(SspCSP2，GenBank登錄號:ALG36155.1)的全長，其開放閱讀框為360bp，編碼120個氨基酸。qRT-PCR實驗技術(shù)分析了SspCSP2在松褐天牛腫腿蜂不同蟲態(tài)、不同組織的表達(dá)情況，結(jié)果表明，SspCSP2顯著表達(dá)于幼蟲、有翅雌蟲的腹部及無翅雌蟲的腹部，其中在有翅雌蟲腹部的表達(dá)量最高。
　　2.重組SspCSP2與氣味物質(zhì)的結(jié)合特性
　　成功構(gòu)建重組質(zhì)粒SspCSP2-

4、pET20b，并大量表達(dá)于大腸桿菌BL21(DE3)中，利用DE52陰離子交換柱成功獲得純凈重組SspCSP2。以1-NPN為探針，利用熒光競爭性結(jié)合試驗，分析SspCSP2在pH7.4和pH5.0條件下與24種氣味分子的結(jié)合特性。結(jié)果表明，在酸性條件下，SspCSP2與大多數(shù)氣味物質(zhì)的結(jié)合能力高于中性條件，22種物質(zhì)展現(xiàn)出與SspCSP2具有較強的結(jié)合能力(Ki＜20μM)，其中(-)石竹烯氧化物、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚和壬醛

5、3種氣味物質(zhì)與SspCSP2的結(jié)合能力最強(Ki＜10μM);相反，SspCSP2與順-3-己烯醇和(+)-α-長葉蒎烯這2種氣味物質(zhì)的結(jié)合能力則為在中性條件下的高于酸性條件;但pH對SspCSP2與反式-2-己烯醇的結(jié)合能力無影響。
　　3.松褐天牛腫腿蜂SspCSP2的熒光猝滅分析
　　Stern-Volmer方程分析SspCSP2與4種具有電生理活性物質(zhì)(α-蒎烯、β-蒎烯、γ-異松油烯與(+)-α-長葉蒎烯）的猝滅類

6、型，結(jié)果顯示4種物質(zhì)均為靜態(tài)猝滅;結(jié)合位點分析發(fā)現(xiàn)，4種物質(zhì)與SspCSP2的結(jié)合比例均為1∶1。熱力學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)，4種物質(zhì)與SspCSP2之間的相互作用力均為疏水性作用力。
　?。ǘ┧珊痔炫Ｄ[腿蜂SspOBP7與氣味分子的結(jié)合機制
　　1.松褐天牛腫腿蜂SspOBP7的熒光猝滅分析
　　SspOBP7與24種氣味分子的猝滅類型和相互作用研究結(jié)果表明，SspOBP7與18種氣味分子的猝滅類型屬于動態(tài)猝滅，余下的6種

7、物質(zhì)屬于靜態(tài)猝滅;6種靜態(tài)猝滅的物質(zhì)中有3種物質(zhì)屬于非極性分子，分別為s-（-）檸檬烯、(+)-α-長葉蒎烯和異松油烯，與SspOBP7形成疏水性作用力;余下3種物質(zhì)，反式-2-己烯醇、順-2-戊烯-1-醇和癸醛則屬于極性分子，與SspOBP7形成氫鍵作用;雙對數(shù)方程分析結(jié)果顯示，6種物質(zhì)與SspOBP7的結(jié)合比例均為1∶1。
　　2.松褐天牛腫腿蜂SspOBP7的結(jié)構(gòu)分析
　　利用圓二色譜法分析了SspOBP7在不同pH值

8、、不同配體配比條件下的二級結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果表明，pH值的變化會引起SspOBP7的α螺旋含量的變化，其中pH7.4條件下SspOBP7的α螺旋數(shù)最多，其次是pH3.0，最少的為pH5.0;設(shè)定pH7.4，SspOBP7的α螺旋數(shù)會隨著配體配比的增加而減少;當(dāng)SspOBP7與配體按1∶1結(jié)合后，改變體系pH值，蛋白的α螺旋數(shù)變化規(guī)律與SspOBP7純蛋白的一致。
　　以意大利蜜蜂Apis mellifera的AmelOBP5(3R72

9、)為建模模板，對SspOBP7進行同源建模。結(jié)果顯示，SspOBP7具有6個α螺旋，3個二硫鍵，屬于Classical OBP;分子對接結(jié)果顯示SspOBP7中央具有一個結(jié)合腔，呈球狀，結(jié)合腔的表面具有三處極性區(qū)域，分別為Thr86、Tyr105和Phe118。分析極性區(qū)域處形成的氫鍵作用，發(fā)現(xiàn)Thr86處與配體形成氫鍵作用時，需要Tyr105的參與，Phe118與配體形成氫鍵作用的位置為主鏈上的氧原子，Tyr105可以單獨與配體形成氫

10、鍵作用，且形成的位置為側(cè)鏈羥基上的氧原子。
　　3.松褐天牛腫腿蜂SspOBP7的定點突變及與氣味分子結(jié)合機制
　　針對Tyr105設(shè)計定點突變，突變成Phe105，目的是破壞氫鍵作用。表達(dá)、純化出重組突變蛋白，測定了突變蛋白與6種靜態(tài)猝滅物質(zhì)的結(jié)合情況。結(jié)果顯示，這6種物質(zhì)與突變蛋白的結(jié)合能力均有一定程度的減弱，但結(jié)合比例沒有改變。突變后的SspOBP7與極性分子葵醛的結(jié)合能力顯著下降，熒光猝滅和分子對接結(jié)果顯示，突變之后

11、氫鍵作用消失;而突變后的SspOBP7與其它2種極性分子，反式-2-己烯醇和順-2-戊烯-1-醇，仍具有較強的結(jié)合能力，熒光猝滅和分子對接結(jié)果顯示，蛋白突變之后，氫鍵作用還存在，只是位置發(fā)生改變;突變后的SspOBP7與3個非極性分子結(jié)合能力明顯減弱，熒光猝滅和分子對接結(jié)果顯示，突變后仍為疏水性作用，但3個分子在結(jié)合腔內(nèi)的取向均發(fā)生了改變。通過對比分析蛋白的結(jié)合腔，發(fā)現(xiàn)SspOBP7突變之后，結(jié)合腔的體積明顯變大。
　　綜上，松褐

12、天牛腫腿蜂SspCSP2基因主要分布在蟲體腹部，SspCSP2對氣味物質(zhì)的選擇性差，SspCSP2與電生理活性物質(zhì)主要是通過疏水性作用力結(jié)合;SspOBP7與24種物質(zhì)中的3種極性分子和3種非極性分子結(jié)合，結(jié)合力分別為氫鍵作用和疏水性作用力，環(huán)境中改變pH值和配體的濃度均會使蛋白的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，極性區(qū)域的破壞會導(dǎo)致SspOBP7的結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變，從而影響蛋白與氣味分子的結(jié)合，相比之下，非極性分子結(jié)合力的改變更明顯，疏水性作用力所受影響