雪上一枝蒿的體內(nèi)外毒性及減毒方法研究.pdf

1、雪上一枝蒿(Aconiti Brachypodi Radix)系毛莨科(Ranunculaceae)烏頭屬(Aconitum)植物短柄烏頭(Aconitum brachypoaum Diels)的藥用塊根，其化學(xué)成分主要為生物堿，具有消炎止痛，祛風(fēng)除濕的功效，臨床上主要用于治療神經(jīng)痛、風(fēng)濕痛、關(guān)節(jié)疼痛、創(chuàng)傷、骨折及手術(shù)后疼痛和晚期腫瘤疼痛等癥。由于雪上一枝蒿有劇毒，使用不當(dāng)容易中毒，而目前對(duì)雪上一枝蒿的毒性研究主要集中在其中毒機(jī)制上，但

2、對(duì)于解救其毒性的天然解毒劑、解毒機(jī)制研究的較少，因此對(duì)其進(jìn)行深入的研究，將有助于尋找新的解毒藥物。
　　本實(shí)驗(yàn)從尋找天然解毒劑著手對(duì)雪上一枝蒿神經(jīng)毒性的解毒方法和機(jī)制進(jìn)行了深入研究，分別以黃芩苷、甘草次酸和金不換中提取的兩種單體混合物D1來(lái)解救雪上一枝蒿總生物堿所致的PC12細(xì)胞毒性，并研究其解毒機(jī)制；以金不換水提物來(lái)解救雪上一枝蒿所致小鼠急性毒性。以尋找天然解毒藥物為目標(biāo)，具有較高的理論和實(shí)踐意義。
　　本研究以PC12細(xì)

3、胞為研究對(duì)象，探討雪上一枝蒿總生物堿所致的細(xì)胞毒性及凋亡，以及對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放、多巴胺(DA)和活性氧(ROS)的影響。采用MTT法，檢測(cè)不同濃度的雪上一枝蒿總生物堿對(duì)PC12細(xì)胞增殖的抑制作用以及同時(shí)或者提前兩小時(shí)孵育黃芩苷和甘草次酸對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用；JC-1熒光染色檢測(cè)線粒體膜電位，用熒光探針DCFH-DA測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平，F(xiàn)lou-3/AM測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。應(yīng)用多巴胺Elisa試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)液上清DA的濃度。結(jié)

4、果表明：雪上一枝蒿總生物堿可顯著降低PC12細(xì)胞存活率，使細(xì)胞內(nèi)的ROS和鈣離子濃度顯著增高，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而黃芩苷和甘草次酸通過(guò)清除細(xì)胞內(nèi)的ROS，降低鈣離子的釋放，降低對(duì)線粒體的損害，提高細(xì)胞的存活率，從而達(dá)到解毒的作用。說(shuō)明雪上一枝蒿總生物堿通過(guò)釋放大量多巴胺引起多巴胺能神經(jīng)的氧化應(yīng)激反應(yīng)從而導(dǎo)致線粒體功能紊亂，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生神經(jīng)毒性。
　　本課題組通過(guò)大量的文獻(xiàn)資料和實(shí)地考察，發(fā)現(xiàn)傈僳族、納西族人民常使用云南金不換來(lái)解

5、救雪上一枝蒿導(dǎo)致的毒性。因此我們以小鼠為研究對(duì)象，進(jìn)行雪上一枝蒿總生物堿急性毒性實(shí)驗(yàn)以及金不換水提物解救急毒實(shí)驗(yàn)，觀察小鼠行為學(xué)變化及病理切片觀察組織病變狀況，使用代謝組技術(shù)分析致毒/解毒所致腦組織中代謝物變化。結(jié)果表明，給予不同劑量雪上一枝蒿總堿后，小鼠表現(xiàn)出各種中毒癥狀，包括干嘔、腹腔式呼吸、松毛、活動(dòng)量減少輕微癥狀，也有抓嘴、出汗、流涎、便秘、眼球凸起的明顯中毒癥狀；25.6-78.13 mg/kg劑量組的急性死亡時(shí)間大部分在10

6、-30 min，死亡前先安靜后躁動(dòng)，眼球凸起，抽搐死亡，表明為高毒性藥物。金不換水提物25-200 mg/kg劑量均不同程度緩解雪上一枝蒿總生物堿的中毒效應(yīng)，且死亡率下降，未死小鼠均在2-4 h內(nèi)恢復(fù)。病理結(jié)果顯示，雪上一枝蒿的毒性靶點(diǎn)主要是心、肝、腎等組織。腦組織未見(jiàn)明顯病變。代謝組分析顯示，空白組與中毒組動(dòng)物代謝特征顯著不同。而解毒組在PC1方向則與空白組重合，說(shuō)明其對(duì)雪上一枝蒿所致的毒性有解救作用。腦組織得分圖顯示，金不換水提物可

7、使代謝輪廓恢復(fù)到與空白組相似的趨勢(shì)。各組間主要代謝物表達(dá)水平表明，金不換水提物可適度調(diào)整雪上一枝蒿總生物堿染毒的腦組織代謝物水平。雪上一枝蒿染毒腦組織中?；撬犸@著增高。而且，腦組織中肌酸,肌醇,谷氨酸,乳酸,絲氨酸和脯氨酸也顯著升高。說(shuō)明金不換水提物能夠明顯減少上述代謝物的升高。
　　在前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究工作基礎(chǔ)上。本研究又以PC12細(xì)胞為對(duì)象，初步探討金不換對(duì)雪上一枝蒿總生物堿所致的細(xì)胞神經(jīng)毒性的解救作用，對(duì)細(xì)胞釋放乳酸脫氫酶(L

8、DH)以及對(duì)Bcl-2表達(dá)水平的影響。采用MTT法，檢測(cè)金不換兩種單體混合物D1對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用；應(yīng)用LDH試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)液上清中LDH漏出量。結(jié)果表明，金不換中提取的兩種單體的混合物D1可明顯增強(qiáng)雪上一枝蒿總生物堿損傷的PC12細(xì)胞活力，降低細(xì)胞LDH的含量，升高Bcl-2在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，說(shuō)明金不換可以降低由于雪上一枝蒿總堿引起的細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到解雪上一枝蒿神經(jīng)毒的作用。其解毒作用與凋亡相關(guān)基因Bcl-2的改變有關(guān)。
　　結(jié)論

9、：雪上一枝蒿總生物堿所造成的神經(jīng)毒性可能是由于增加胞內(nèi)多巴胺的釋放，而大量多巴胺的釋放引起多巴胺能神經(jīng)的氧化應(yīng)激反應(yīng)從而導(dǎo)致線粒體功能紊亂，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而產(chǎn)生神經(jīng)毒性。黃芩苷和甘草次酸通過(guò)清除細(xì)胞內(nèi)的ROS，降低鈣離子的釋放，降低對(duì)線粒體的損害，提高細(xì)胞的存活率，從而達(dá)到解毒的作用。金不換水提物可以明顯降低牛磺酸、肌酸等代謝物在小鼠體內(nèi)的升高，緩解其中毒癥狀，從而達(dá)到解毒效果。金不換中提取的兩種單體混合物D1也可以降低由于總堿引起的細(xì)